Методическая разработка по дисциплине Ботаника и физиология растений

9
Тема: Транскрипция РНК. Транскрипция прокариот и эукариот. Структура транскриптонов. Регуляция транскрипции у прокариот и эукариот
План:
Транскрипция РНК у про- и эукариот.
Структура транскриптонов.
Этапы транскрипции
Регуляция транскрипции у прокариот и эукариот.

Транскрипция РНК у про- и эукариот. Транскрипция - это синтез РНК на матрице ДНК. В результате образуются матричные РНК (м-РНК), в которых закодирована аминокислотная последовательность белков, транспортная РНК (т-РНК), рибосомальная РНК (р-РНК) и другие виды РНК
У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом.
У эукариот различают 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы.
Субстратами для РНК-полимераз служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии макроэргических связей актвированных нуклеотидов.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Принципы транскрипции:
1. Комплементарность.
2. Антипараллельность.
3. Униполярность.
4. Беззатравочность.
5. Асимметричность.
РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5'[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]3'. Для начала синтеза РНК фермент не нуждается в поли- или олигонуклеотидной затравке.
Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.



Синтез РНК на матрице ДНК включает стадии инициации, элонгации, терминации.
Синтез РНК осуществляется РНК-полимеразами.
Субъединичный состав РНК-полимеразы Е.coli
РНК-полимераза Е.coli - белок с четвертичной структурой. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы.
Субъединичный состав фермента: (2
·)
·
·’
· - holo-фермент (полный фермент). Без
·-фактора это core-фермент (2
·)
·
·’
·.

· (сигма) - фактор - сменный фактор специфичности.
Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У core-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.

·- фактор придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.
Как только произошла инициация транскрипции,
·-фактор отделяется. Элонгация - продолжение синтеза РНК, и терминация - его остановка, осуществляются core-ферментом.
Две
· субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.
·’- субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот. В
·- субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.

2. Структура транскриптонов. Участок ДНК на котором происходит транскрипция включает участок промотора, оператора, структурные гены, терминатор, ген белка репрессора, регуляторные участки.
Процессу транскрипции подвергаются отдельные участки ДНК – транскриптоны. Они ограничены 2-мя нуклеотидными последовательностями – промоторами (начало транскрипции) и терминаторами (конец транскрипции).
Транскриптоны бактерий называются оперонами. Опероны включают в себя цистроны (или структурные гены), кодирующие структуру нескольких белков. Транскрибируемая м-РНК является полицистроновой и используется для синтеза нескольких белков.
У эукариот м-РНК содержит информацию только об одном белке. На интенсивность транскрипции влияет пространственная структура ДНК (изгибы, петли, сверхспирализация, возможность присоединения региональных белков). Регуляторные элементы связываются с нуклеотидной последовательностью как в транскриптонах, так и на удаленных участках энхасерах и адапторных элементах.
Структура промотора
Промоторы отличаются и по первичной, и по вторичной структуре. Путем секвенирования выявили структуру многих промоторов. В структурных генах E. сoli имеется 2 сайта связывания РНК-полимеразы.
1) ТАТААТ – ТАТА-бокс (бокс Прибнова) расположен за 10 нуклеотидных
АТАТТА осатков от сайта инициации транскрипции
2) ТТГАЦ – за 35 нуклеотидных осатков от сайта инициации транскрипции
ААЦТГ
.13 EMBED Word.Picture.8 1415
РНК-полимераза узнает промотор, покрывая 40-60 пар нуклеотидов. В промоторе узнается взаимное расположение двух расплавленных AT-богатых участков.
В каждом из них расплавлено 4-6 пар. Центры этих участков находятся в положенях "-10" и "-35". Принципиально важным является расстояние между расплавленными участками. Оно колеблется от 16 до 19 п.н. Искусственное увеличение этого расстояния до 20 п.н. или уменьшение его до 15 п.н. приводит к тому, что РНК-полимераза не узнает испорченный промотор.
Этапы транскрипции
1. Узнавание и прочное связывание
После узнавания РНК полимеразой промотора, РНК-полимераза перемещается к оперону и в каталитическом центре инициации транскрипции, находящемся в (-субъединице, оказывается +1-ый нуклеотид оперона, если на операторе нет белка-репрессора.

2. Инициация транскрипции заключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между пурин-трифосфатом (АТФ или ГТФ) и следующим нуклеотидом. После инициации
·- фактор покидает фермент.
3. Элонгация - последовательное наращивание цепи РНК (или продолжение транскрипции).
Скорость элонгации 40-50 нукл./сек. Для комплементарного синтеза РНК необходим разрыв водородных связей в ДНК. Core-фермент РНК- полимеразы покрывает примерно 40 пар нуклеотидов (4 витка спирали ДНК). Разрыв водородных связей на 4-х витках спирали - очень энергоемкий процесс. Он не был обнаружен при изучении транскрипции.
При транскрипции используется энергия, высвобождающаяся при отщеплении пирофосфата от каждого рибо-НТФ.
4. Терминация.
Специфическая терминация бывает (- независимой и (- зависимой. (-зависимая терминация.
При (- независимой терминации в терминаторе присутствует палиндром. В синтезируемой РНК формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК-полимеразы и фермент теряет сродство к ДНК.
(- фактор - это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. Он способен узнавать 5`-конец синтезируемой РНК длиной приблизительно 50 нуклеотидов, садиться на него и двигаться по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК.
В терминаторе много Г-Ц пар (с тремя водородными связями), вследствие чего РНК-полимераза замедляет ход, (- фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента - и синтез РНК прекращается.
Транскрипция у эукариот
У эукариот процессы транскрипции и трансляции разобщены во времени и пространстве (транскрипция - в ядре, трансляция - в цитоплазме).
У эукариот существуют специализированные РНК-полимеразы.
В ядре выделяют 3 типа РНК-полимераз:
РНК-полимераза I - синтезирует rРНК (кроме 5S rРНК).
РНК-полимераза II - синтезирует mРНК и некоторые sРНК.
РНК-полимераза III - синтезирует tРНК, некоторые sРНК и 5SrРНК.
РНК-полимеразы различаются количеством субъединиц, их аминокислотным составом, и зависимостью от катионов магния и марганца. Для РНК-полимераз I и III необходимое для работы соотношение [Mn2+]/[Mg2+] = 2. Для РНК-полимеразы II - [Mn2+]/[Mg2+] = 5.
У эукариот есть РНК-полимеразы хлоропластов и митохондрий. Они кодируются в ядре. В органеллах образуются свои tРНК, rРНК и рибосомные белки.
Особенности транскрипции эукариот
Единицей транскрипции у эукариот является отдельный ген, а не оперон, как у прокариот. Оператор, как таковой, отсутствует.
Промотор организован иначе.
На расстоянии -25 п.н. от +1 нукл. находится ТАТА-бокс. Его позиция определяет точку инициации транскрипции. А на расстоянии -60-80 п.н. находится ЦААТ-бокс, который не является абсолютно необходимым, но присутствует перед большинством генов.
Расстояние между ЦААТ и ТАТА большое и РНК-полимераза не способна накрыть всю эту область.
ЦААТ опознается своим белком, а ТАТА - своим.

К эукариот есть несколько белков, называемых базальными факторами транскрипции.
Базальные факторы транскрипции - белки, необходимые для инициации транскрипции всеми тремя ядерными РНК-полимеразами. Это TF-факторы (TF-I, TF-II, TF-III). Особенностью белковых регуляторов является то, что они присоединяются в различных местах ДНК относительно точки инициации.
Влияние на трансляцию оказывает также энхасеры, сайленсоры и адапторные элементы (инициирующие синтез белков теплового шока)

3. Регуляция транскрипции у про- и эукариот.
В клетке инициируется транскрипция структурного гена, если возникает потребность в каком-либо белке. Когда потребность исчезает, транскрипция выключается.
Регуляция транскрипции прокариот. Нуклеотидная последовательность, в которой закодировано более одного белка, называется опероном (белки одного метаболитного пути). Происходит синтез м-РНК, кодирующей несколько белков. Оперон находится под контролем одного промотора
Между ТАТА-боксом и +1 (начало инициации) находится оператор (или активатор). Оператор может связываться с регуляторным белком: при этом преграждает перемещение РНК полимеразы по ДНК.
Но регуляторный белок может быть связан с веществом клетки – эффектором, при этом РНК-полимераза перемещается в центр инициации и осуществляется синтез м-РНК.
Эффекторы разрушаются ферментами клетки, - уменьшение концентрации эффектора, белок репрессор связывается с оператором, транскрипция прекращается.
Второй способ регуляции: репрессор (регуляторный белок) находятся в неактивном состоянии, т.е. не способен связываться с оператором. Если в среде появляется специфический эффектор (корепрессор), он изменяет конформацию репрессора таким образом, что он может связываться с оператором, следовательно, транскрипция включается.
Ингибиторы транскрипции прокариот.
Существует множество ингибиторов транскрипции. Они действуют по разным механизмам и на разных стадиях. Большинство из них - антибиотики.
Рифампицин - ингибитор инициации. Связывается с центром инициации holo-РНК-полимеразы E. сoli.
Стрептолидигин - ингибитор элонгации. Связывается с центром элонгации core-РНК-полимеразы E. сoli.
Регуляция транскрипции Lac -оперона E. Сoli.

Как только лактоза попадает в клетку, две молекулы субстрата (лактозы) взаимодействуют с белком - репрессором, изменяют его конформацию - и он теряет сродство к оператору. Начинается транскрипция lac-оперона и трансляция образующейся mРНК; три синтезируемых белка участвуют в утилизации лактозы.
Когда вся лактоза переработана, очередная порция репрессора, свободного от лактозы, выключает lac-оперон.
Контролирующим транскрипцию фактором является негативный фактор, "выключатель" - белок - репрессор. Индукция (включение) происходит при потере сродства белка - репрессора к оператору.
Существует и позитивная регуляция работы lac-оперона E. coli.
Регуляция транскрипции у эукариот.
Набор структурных генов – генов «домашнего хозяйства» транскрибируется во всех клетках. Специфические гены транскрибируются и транслируются в определенных клетках (
· и
· субъединицы гемоглобина синтезируются только в клетках эритроцитов).
Регуляция транскрипции структурных генов важна для поддержания клеточной специфичности и экономичного расходования энергии.
Существует много процессов регуляции, но общим является то, что регуляция осуществляется с помощью специфических белков.
В отличие от прокариот у эукариот опероны отсутствуют и каждый структурный ген имеет свою регуляторную систему.
Промоторный участок эукариот содержит
ТАТА-бокс – БОКС Хогнесса – из нуклеотидов, включающий последовательность ТАТА
ЦАТ – бокс
ГЦ-бокс
Транскрипция начинается со связывания ТАТА-бокса
TF-II D – фактор транскрипции- состоит из 14 белков. TF-II D и участки ДНК прилегающие к ТАТА-боксу связываются с другими факторами транскрипции TF-II В, затем к этому комплексу присоединяется РНК-полимераза.
При участии дополнительных факторов запускается транскрипция.
Для любого гена, кодирующего белок, есть энхансеры (усилители).
Энхансеры - последовательности ДНК, усиливающие транскрипцию при взаимодействии со специфическими белками.
Энхансеры - это прерывные последовательности нуклеотидов. Существуют так называемые модули - это отдельные части энхансеров. Одинаковые модули могут встречаться в разных энхансерах. Для каждого энхансера набор модулей уникален. Модули - это короткие последовательности, не более 2-х витков спирали (20 п.н.), которые могут находиться перед, за и даже внутри гена.
Таким образом, М1+М2+М3+М4 - один энхансер, но он состоит из 4-х модулей. Все 4 модуля узнаются своими белками, а они, сидя на ДНК, взаимодействуют друг с другом. Если в клетке присутствуют все соответствующие белки, то участку ДНК придается определенная конформация и начинается синтез mРНК.
Сайленсеры - последовательности ДНК, ослабляющие транскрипцию при взаимодействии с белками.
При соответствующем наборе белков экспрессия отдельных генов в клетке может быть подавлена.
Идентифицированы факторы транскрипции для 2 других регуляторных элементов ГЦ и ЦЦААТ. Но механизм регуляции транскрипции недостаточно изучен. Т. о., структурный ген эукариот имеет множество регуляторных элементов, которые активизируются специфическими сигналами в клетках разного типа в разное время клеточного цикла.
Влияние хроматина на транскрипцию и репликацию.
Гистоны могут метилироваться, фосфорилироваться (по серину, треонину, тирозину), т.е. аминокислотные остатки легко модифицируются. Кроме того, возможно алкилирование и ацетилирование гистонов, фосфорилирование аминокислот. Модификации гистонов влияет на компактизацию ДНК- разрыхляет или уплотняет, следовательно меняется доступность факторов инициации и ферментов транскрипции и репликации к участкам ДНК, в которых находятся кодирующие последовательности.








13PAGE 15


13PAGE 14215




15