Методическая разработка по теме :Ферменты

Глава 3. ФЕРМЕНТЫ

Ферментами или энзимами называют вещества белковой природы, ускоряющие протекание химических реакций. Ферменты отличаются тремя уникальными свойствами: 1) это самые эффективные из известных катализаторов; 2) большинство ферментов отличаются специфичностью действия; 3) действие их регулируется, т.е. они способны переходить от состояния с низкой активностью к состоянию с высокой активностью и обратно.
Все ферменты относятся к глобулярным белкам, причем каждый фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему структурой. Однако максимальная активность многих (но не всех) ферментов зависит от участия небелковых соединений, называемых кофакторами.
Различают неорганические кофакторы ( например, Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, K+, Na+) и органические, которые обычно называют коферментами, (большая часть их представляет собой витамины).
Молекулярный комплекс белка и кофактора называют холоферментом; он обладает максимальной каталитической активностью. Белковый компонент, лишенный кофактора, называется апоферментом, он обладает очень низкой активностью, а часто вообще неактивен.
Тип сязи между кофактором и ферментом может быть различным. В некоторых случаях они существуют отдельно и связываются друг с другом только на время протекания реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно, иногда очень прочно, ковалентными связями.
Как белковые вещества, ферменты термолабильны и теряют активность при температурах, при которых происходит денатурация белка.
Для каждого фермента существует оптимальная область значений рН, в которой он наиболее активен.
Важным свойством ферментов является их специфичность действия. Некоторые из них обладают абсолютной специфичностью: каждый фермент катализирует единственную реакцию, вследствие того, что топография активного центра такого фермента соответствует топографии одного-единственного субстрата.
Многие ферменты обладают лишь относительной специфичностью – они способны катализировать один тип реакции с более чем одним структурно-подобным субстратом.
Хотя детальный механизм действия каждого фермента уникален, все ферменты "работают" сходным образом: фермент Е обратимо связывается с субстратом S с образованием промежуточного фермент-субстратного комплекса ЕS, котрый затем распадается с образованием продукта Р и свободного фермента Е в исходном виде:
Е+ S ( Е S ( Р + Е
Скорость ферментативного процесса описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, связывающего концетрацию субстрата [S] с начальной скоростью V0 :
V0 = Vmax [S] / Km + S
где Vmax – максимальная скорость; Km – константа Михаэлиса; [S] – концентрация субстрата.
В большинстве случаев о количестве ферментов судят по его активности.
Согласно Междурудной номенклатуре, ферментативную активность выражают в каталах (сокращённо –кат). Один катал – есть каталитическая активность способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль в секунду.
Также для выражения активности используются единицы активности фермента (Е).. 1Е катализирует превращение субстрата со скоростью 1мкмоль/мин при оптимальных условиях. 1Е =16,67 нкат.
Удельная активность фермента выражается числом единиц Е на 1мг белка, концентрация фермента в растворе – числом единиц Е на 1мл.
Удельную активность можно расчитать по формуле:
Еуд = Емол ( 1000/ Мr
Где Еуд – удельная активность; Емол – молярная (молекулярная) активность; Мr – относительная молярная масса фермента.
Молярная активность (или число оборотов) выражается числом молей субстрата, реагирующего с 1 молем фермента за 1мин.
Все ферменты по типам катализируемых реакций подразделяются на 6 классов:
оксиредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции; трансферазы - катализируют межмолекулярный перенос различных химических групп; гидролазы – гидролитически расщепляют химические связи; лиазы – расщепляют связи способом, отличным от гидролиза и окисления; изомеразы – ускоряют реакции взаимопревращения различных изомеров; лигазы – катализируют реакции образования связей в реакции конденсации двух различных соединений за счет энергии гидролиза АТФ.
Каждый из названных классов, в свою очередь, делится на подклассы и имеет свой шифр из четырехзначного числа.
Действие ферментов может усиливаться веществами, которые называются активаторами ( соли, ионы металлов и др.); противоположное, тормозящее влияние оказывают на ферменты ингибиторы. Действия большинства лекарственных препаратов, инсектицидов и гербицидов основано на способности ингибировать (затормаживать) работу клеточных ферментов (обычно какого-то
определенного).
Пример 1. В реакцию вступило 10-6 М фермента, для которого характерно 6·105 с-1 оборотов. Рассчитайте концентрацию образующегося продукта.
Решение: Под числом оборотов понимается число молей субстрата, катализируемой 1 молем фермента.
Значит: 1 моль фермента катализирует образование 6 · 105 моль продукта
10-6 ------- х

х = 10-6 · 6·105/1= 6·10-1.
Ответ: 6·10-1 М.

Пример 2. Относительная молекулярная масса пируваткарбоксилазы (Мr) 183 кДа. Рассчитайте молекулярную активность фермента, если его удельная активность составляет 1,2·103Е.
Решение: Воспользуемся формулой:
Еуд = Емол. · 1000 /Мr ; Значит, Емол =1,2·103 · 1,83·105 / 1·103 = ~2,2·105.
Ответ: 2,2 · 105.
Пример:3. При какой концентрации субстрата фермент для которого максимальная скорость превращения субстрата составляет 40 мкмоль/мин, а величина Км= 0,002М будет работать со скоростью равной 1/8 максимальной.
Решение: Воспользуемся формулой:

V0 = Vmax [S] / Km + S;

Согласно условию V0 = Vmax/8 = 40 мкмоль/мин /8 = 5мкмоль/мин.

Значит: 5мкмоль/мин = 40 мкмоль/мин · [S]/ 0,002М + [S].

[S] = ~ 2,8·10-4 моль.



Для закрепления темы предлагается решение следующих задач:
1. При нагревании раствора содержащим гексокиназу фермент постепенно утрачивает свою каталитическую активность . Почему?
2. Ферментативная активность лизоцима максимальна при рН=5,2 и уменьшается как при снижении, так и при повышения этого количества рН. Объясните почему?

3.Печень крысы гомогенизировали, затем фракционировали на субклеточные фракции путём дифференциального центрифугирования.


Условия опыта
Субклеточные фракции


Ядерная
Митохонд-
риальная
Микро
сомная
Клеточ
ный сок

Количесво превращённого
субстрата (в мкмоль на пробу)
200
500
320
240

Время икубации фермента с
Субстратом (в мин)
5
15
10
8

Объём пробы (в мл)
0,5
1,0
2,0
0,4

Концентрация белка (в мг/мл)
2.5
3,2
0,8
0,8


В каждой фракции определяли активность гистидазы – фермента, катализирующего отщепление аминогруппы от гистидина. Условия для определения активности даны в таблице. Определите локализацию гистидазы. Обоснуйте свой ответ. ( Гистидаза в основном локализована в клеточном соке ).
В таблице представлены данные, характеризующие зависимость ферментативной реакции (V) от концентрации субстрата (S):

S, M
V, мкм/мин

1·10-6
20

2·10-5
32

1·10-4
39

1·10-3
40


Используя данные таблицы, нарисуйте график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Найдите приблизительные значения Vmах и Km. (Vmах =40 мкм/мин; Km = 1·10-6М).

Рассчитайте удельную активность фермента, если за 30с 1 мг фермента катализирует (при оптимальных условиях) превращает 50 мкмоль пирувата. (мкмоль пирувата · мин-1· мг-1).

3. Сладкий вкус зерён в свежесобранных початках кукурузы обусловлен высоким содержанием в них сахара. Кукуруза, которую продают через несколько дней после сбора, имеет более низкую сахаристость, так как около 50% свободного сахара в зёрнах превращаются в крахмал в течение одного дня хранения. Чтобы сохранить сладкий вкус свежесобранной кукурузы, очищенные початки помещают на несколько минут в кипящую воду («бланшируют»), а затем охлаждают в холодной воде. Кукуруза, обработанная таким образом и хранящаяся в замороженном виде, сохраняет свой сладкий вкус. В чём биологическая основа этой обработки?
4. Активный центр фермента обычно представляет собой «карман» на поверхности фермента, выстланный боковыми цепями аминокислот, необходимыми для связывания субстрата и катализа его химического превращения. Молекула карбоксипептидазы, последовательно отщепляет С-концевые аминокислотные остатки от субстратов (пептидов), состоит из одной полипептидной цепи (307 аминокислотных остатков). Три главные каталитические группы в активном центре –это аргинин 145, тирозин 248 и глутаминовая кислота 270 (номер указывает положение аминокислоты в аимнокислотной последовательности фермента).
а) Если бы карбоксипептидаза представляла собой идеальную
·-спираль, то на каком расстоянии в нм друг от друга находились бы аргинин 145 и тирозин 248; аргинин и глутаминовая кислота 270 ? (18,8 нм).
б) Объясните каким образом эти три аминокислоты, расположенные так далеко друг от друга в полипептидной цепи, могут катализировать реакцию, участники которой занимают пространство размером в несколько десятых долей нанометра?
в) Если в процессе гидролиза участвуют только эти каталитические группы, для чего ферменту необходимо иметь так много аминокислотных омстатков?
5) Фермент уреаза повышает скорость гидролиза мочевины при рН=8,0 и 20(С в 1014 раз. Если данное количество уреазы может полностью гидролизовать данное количество мочевины за 5 мин при рН 8,0 и 20(С, сколько времени потребовалось бы для полного гидролиза мочевины в тех же условиях без уреазы? Предполагается, что обе реакции проходят в стерильных условиях без доступа бактерий. (9,5( 108).
6. Почему в пробирке, содержащей раствор крахмала и слюны человека, при проведении реакции Троммера наблюдается красное окрашивание?
7. Почему добавление фенолфталеина в раствор, содержащий мочевину и фермент уреазу, вызывает розовое окрашивание?
8.Метанол (древесный спирт), который когда-то использовался как антифриз для автомобилей, очень токсичен; приём внутрь всего лишь 30мл метанола может привести к смерти. Такая необычайно высокая токсичность метанола обусловлена действием не столько самого метанола, сколько продукта его метаболизма – формальдегида. Метанол быстро окисляется до формальдегида под действием фермента печени алкогольдегидрогеназы:
NAD+ + CH3OH ( NADH + H+ + HCOH
Одним из методов лечения при отравлении этанолом состоит в том, что больному назначается этанол (этиловый спирт) либо внутрь, либо внутривенно в количествах, которые у здорового человека вызывают интоксикацию. Объясните, почему такое лечение оказывается эффективным?
9. Установлено, что 1г гемоглобина соединяется с 1,34мл кислорода при н.у. Гемоглобин содержит 0,335% железа. Используя эти данные, оцените молярные соотношения кислорода и железа в гемоглобине при полном насыщении его кислородом. (1моль Fe соединяется с примерно 1моль 02).
10. Гемоглобин взаимодействует с кислородом с образованием комплекса, в котором на 4 моль кислорода приходится 1 моль гемоглобина. Вычислите число молекул гемоглобина, необходимое для переноса 1мл кислорода (н.у.). (6,7(1018).
11.Вычислите в нанометрах длину молекулы рибонуклеазы, содержащей 124 аминокислотных остатка, если она а) существует в линейной конфигурации; б) полностью альфа-спирализована (а-44,64нм; б- 18,6нм).
12.Молекула папаина (растительная протениаза) содержит в своём составе 211 аминокислотных остатков. Псевдокристалическая часть молекулы папаина состоит из четырёх коротких (-спиралей, каждая из которых содержит 10 аминокислотных остатков, и фрагмента полипептидной цепи из 9 аминокислотных остатков, находящегося в (-конформации. Определите количество аминокислотных остатков, составляющих аморфную часть молекулы папаина, и степень спирализации, характерную для данного белка. (162 аминокислотных остатка; 19%).
13. Ренгеноструктурный анализ показал, что в молекуле карбоксипептидазы около 30% аминокислотных остатков включены в состав (-спирпалей, а 20% - сосредоточены в зоне, образованной регулярно повторяющимися складками вытянутой полипептидной цепи. Рассчитайте количество аминокислотных остатков, находящихся в аморфной части молекулы, а также в её (-спиральной области и складчатой зоне, если общее число аминокислотных остатков в молекуле карбоксипептидазы равно 255. (128-в аморфной; 76-в (-спирпальной; 51 - в складчатой (-структуре ).
14.Рассчитайте концентрацию меди (%) в медьсодержащем ферменте аскорбатоксидазе (М=150 тыс) если каждая молекула содержит 6 атомов меди. ((0,25%).
15.Рассчитайте молекулярную массу протомера кристалическоой каталазы, представляющего протеид с активной группой в виде железо-порфированного комплекса с одним атомом железа, если концентрация железа в кристалической каталазе равна 0,12%. (46780).
16.Рассчитайте молекулярную массу дигидрооратдегидрогеназы, в состав которой входит 2 атома железа при содержании последнего 0,18% . (62200).
17. В состав сукцинатдегидрогеназы сердца входят 8 атомов железа при содержании последнего 0,22%. Рассчитайте молекулярную массу фермента. ( (200тыс).
18. При какой концентрации субстрата фермент, для которого максимальная скорость превращения субстрата представляет 30 мкмоль/мин(г , а величина Км=0,005М, будет работать со скоростью, равной ј максимальной? (1,7(10-3).
19. Фермент карбоангидраза в концентрации 10-6 М катализирует образование 0,6М Н2СО3 в секунду, согласно реакции: Н2О + СО2 ( Н2СО3. Определите число оборотов характерное для фермента. (6·105 ).
20.Для карбоангидразы характерно 6·105 с-1 оборотов. Рассчитайте концентрацию фермента (в молях) необходимую для образования 0,6 М Н2СО3 в секунду, согласно реакции Н2О + СО2 ( Н2СО3. (10-6 М).
21.Рассчитайте концентрацию образующегося продукта (в молях) в ферментативной реакции Н2О + СО2 ( Н2СО3, катализируемой карбоангидразой, если в реакцию вступило 10-6 фермента. Для карбоангидразы характерно 6·105 с-1 оборотов. (0,6 М).
22. Относительная молекулярная масса пируваткарбоксилазы – Мr = 183тыс., альдолазы - Мr = 142тыс., пируваткиназы - Мr = 237тыс., цитохром – С-редуктазы – М = 75тыс.. Рассчитайте молекулярную активность фермента, если их удельная активность составляет 1,2 · 103 Е; (30 Е; 26Е ; 1,73 · 102 Е соответственно. (2,2 · 105 ; 4,2 · 103 ; 6,0 · 103 ;
1,3 · 104 ).
23. Рассчитайте удельную активность каталазы (Мr=252тыс.), лактатдегидрогеназы (Мr=140тыс.), карбоангидразы (Мr=30тыс.) активность бутирил-СоА-дегидрогеназы (Мr=200тыс.), если их молекулярная активность составляет 5 · 106; 3,7 · 104; 0,96 · 108; 1,3 · 104 соответственно. (2,0 · 104 ; 3,2 · 106 ; 3,2 · 106; 102).
24.Карбоангидраза эритроцитов, имеющая молекулярную массу 30тыс катализирует обратимую реакцию гидратации СО2:
Н2О + СО2 ( Н2СО3,
которая играет важную роль в транспорте СО2 из тканей в лёгкие. Рассчитайте число оборотов карбоангидразы, если при оптимальных условиях 10мкг чистой карбоангидразы катализируют гидратацию 0,30г СО2 в 1мин при 37(С. (2,0(107 мин-1).
25.Укажите какие пептиды получаются при воздействии химотрипсина на полипептид, имеющий первичную структуру: (Н2N) сер-тир-мет-глу-гис-фен-арг-три-гли-лиз-про-вал-гли-(лиз)2-(арг)2-про-вал-лиз-вал-тир-про-асп-гли-ала-глу-асп-глу-лей-ала-глу-ала-фен-про-лей-глу-фен (ОН). (сер-тир; мет-глу-гис-фен; арг-три; гли-лиз-про-вал-гли-(лиз)2-(арг)2-про-вал-лиз-вал-тир; про-асп-гли-ала-глу-асп-глу-лей-ала-глу-ала-фен; про-лей-глу-фен ).



: Heading 16 Heading 2> Heading 38 Heading 4> Heading 5Ў<Default Paragraph Fontт< Body Text<Body Text 2IRB,D:\Кравченко7\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor LakhvichKC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of Глава 3.asdTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.docTodor Lakhvich9D:\My Documents\Kravchenko\Cб. задач\Глава 3.Ферменты.doc