Репликация ДНК

	Загрузить архив:
	Файл: ref-22925.zip (335kb [zip], Скачиваний: 82) скачать

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК.

                                                                 

                                                                      Реферат

студента 3 курса 6 группы

                                                       Ковальчука К.В.

Минск 2003г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение……………………………………………………………………………….3                                                                                                                           

Общий механизм репликации …………………………………………………………4                                                                                         

Основные ферменты репликации ……………………………………………………..5

                                                                  

Репликация у прокариот ……………………………………………………………….7                                                                                                  

Репликация у эукариот …………………………………………………………………9                                                                                                     

Заключение …………………………………………………………………………….. 11                                                                                                                       

Литература ………………………………………………………………………………11                                                                                                                         

Введение.

Вся информация о строении и функционировании любого организма содержится в закодированном виде в его ге­нетическом материале, основу которого у подавляющего числа организмов составляет ДНК.Роль ДНК заключа­ется в хранении и пере­даче генети­ческой (наследственной) информации в живых организмах. Чтобы эта инфор­мация могла переда­ваться от одного поколения клеток (и организмов) к другому, необходимо её точное копиро­вание и после­дующее распределение её копий между потомками. Процесс, с помощью которого создаются копии молекулы ДНК, называется реплика­цией. Перед тем как раз­делится, клетки с помощью реп­ликации создают копию своего генома, и в результате клеточного деленияв каждую дочер­нюю клетку переходит одна копия. Бла­годаря этому, генетическая информация, содержащаяся в роди­тельской клетке, не исчезает, а сохраняется и пере­даётся потомкам. В случае многоклеточных организмов пе­редача этой информации осуществляется с помощью половых клеток, образующихся в результате мейотического деления и также несущих копию генома (гаплоидного). Их слияние приводит к объеди­нению двух родительских геномов в одной клетке (зиготе). Из неё развивается организм, клетки которого не­сут ге­нетическую информацию обоих родительских организмов. Таким образом, основное значение репликации за­ключается в снабжении потомства генетической информацией. Для обеспечения стабильности организма и вида ДНК должна реплицироваться полностью и с очень высокой точностью, что обеспечивается функционированием определённого набора белков. Замечательной особенностью ДНК является то, что она несёт гены кодирующие эти белки, и, таким образом, информация о механизме её собственного удвоения за­кодирована в ней самой.

Общий механизм репликации.

Точное самовоспроизведение ДНАвозможно благодаря её особой структуре. Модель структуры ДНК была об­народована Ф.Криком и Д.Уотсоном в 1953 году. Согласно ейДНК представляет собой длинную двухцепочечную полимерную молекулу. Мономерамиявляются нуклеотиды, соединённые в каждой цепи фос­фодиэфирными связями. Сахарофосфатный остов молекулы, который состоит из фосфатных групп и дезоксири­бозных остатков соединён­ных 5'-3'-фосфодиэфирными связями , образует как бы боковины винтовой лестницы, а пары оснований -её ступеньки.Две полинуклеотидные цепи навиты одна на одну, образуя двой­ную спираль. Вместе они удерживаются водородными связями , образующимися между комплиментарными основаниями про­тивоположных цепей (между А и Т; G и C). Цепи молекул ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 5¢®3¢, другая 3¢®5¢. Последовательность мономер­ных единиц (дезоксирибонуклеоти­дов) в одной её цепи соответствует (ком­пли­ментарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Уот­сон и Крик предположили, что для удвое­ния ДНК должны произойти раз­рыв водородных связей и расхожде­ние це­пей(рис.1) и что удвоение ДНК происходит путём последовательного соедине­ния нуклеотидов на мат­рице материнской цепи в соответствии с правилом комплиментарности. В даль­нейшем эта матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными опытами. Подтверждение также получил пред­ложенный полуконсервативный способ репликации двухцепочечной ДНК {Мезельсон, Сталь, 1958 (объект-E.coli); Тэйлор,1958( объект-Viciafaba)}.Согласно ему, в результате дупликации образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской (консервативной), а вто­рая- заново син­тезированной.Другие механизмы (консервативный, дисперс­ный) не под­твердились.

рис.1. Рис.1Модель репликации, предложенная Уотсоном и Криком. Комплиментарные цепи показаны разными цветами.

   зоны, где происходила репликация. Эта зона двига­лась вдоль роди­тельской двойной спирали. Из-за Y-образной структуры её назвали реплика­тивной вилкой. Именно в ней и происходят основные процессы, обеспечивающие синтез ДНК. Вилки образуются в структуре, называемой репликативный пузырёк. Это области хромосомы, где две нити родительской спи­рали ДНК разъединяются и служат как матрицы для синтеза ДНК. Это место, где происходит инициация реп­ликации, называется точкой начала реп­ликации (точкой ori). Образование репликативных вилок происходит в двух направлениях (двунаправленная репликация) и их они затем движутся до встречи с другой вилкой или с кон­цом матрицы. В некоторых слу­чаях наблюдается движение только одной вилки, тогда как вторая является ста­ционарной (однонаправленная репликация). У прокариот на нуклеоиде находится обычно только одна точка ori, тогда как у эукариот их много (например, у дрожжей порядка 500), рас­положенных на хромосоме на расстоянии 20-35 т.п.н. Участок между двумя точками ori получил название репли­кон. Скорость репликации у прокариот со­ставляет порядка 1000-2000 нуклеотидов в секунду, у эука­риот ниже из-за нуклеосомной органи­зации хроматина (10-200 нук­леотидов в секунду). Скорость репликации всей молекулы ДНК (или хромо­сомы) зависит от числа и распо­ложения точек ori.

Синтез ДНК в репликативной вилке проходит следующим образом. Цепи синтезируются в результате присоеди­нения 5¢-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксирибонуклеотидтрифосфатов к 3¢-гидроксильному концу уже имеющейся цепи (праймер, затравка). За один акт репликации праймерная цепь удлиняется на один нуклеотид, при этом одновременно удаляется один остаток пирофосфата. Цепи синтезируются в направ­лении 5¢®3¢ вдоль мат­ричной цепи, ориентированной в противоположном, 3¢®5¢, направлении. Синтез Цепей в обратном направлении не происходит никогда, поэтому синтезируемые цепи в каждой репликативной вилке должны расти в противоположных направлениях. Синтез одной цепи(ведущей, лидирующей) происходит непрерывно, а другой (отстающей) импульсами. Такой механизм репликации называется полунепрерывным. Ведущая цепь растёт от 5¢- к 3¢-концу в направлении движения репликативной вилки и нуждается только в одном акте ини­циации. Рост от­стающей цепи также идёт от 5¢- к 3¢-концу, но в направлении противоположном движению реп­ликативной вилки. Для синтеза отстающей цепи должно произойти несколько актов ини­циации, в результате чего образуется множе­ство коротких цепей, называемых фрагменты Оказаки в честь от­крывшего их учёного - Р.Оказаки. Размеры их: 1000-2000 нуклеотидов у прокариот, 100-200 нуклеотидов у эукариот. По мере дви­жения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с обра­зованием непрерывной отстающей цепи. Механизмы инициации репликации в точке ori и при образовании фрагментов Оказаки в принципе аналогичны. В обоих слу­чаях происходит образование РНК- затравок (дли­ной 10-12 нуклеотидов), комплиментарных матричной ДНК, в виде продолжения которых синтезируется но­вая цепь ДНК. В дальней­шем короткие вставки РНК  замещаются сегментами ДНК, которые затем объединя­ются с образованием не­прерывных цепей.

Основные ферменты репликации.

Репликация является ферментативным процессом, а не спонтанным как сначала предполагали Уотсон и Крик. В ре­пликации участвуют следующие основные группы ферментов.

ДНК-полимеразы. Ферменты, которые узнают нуклеотид материнской цепи, связывают комплиментарный нук­леозидтрифосфат и присоединяют его к 3¢-концу растущей цепи 5¢-концом. В результате образу­ется 5¢-3¢-диэфирная связь, высвобождается пирофосфат и растущая цепь удлиняется на один нуклеотид. Та­ким об­разом, ДНК-поли­мераза движется от 3¢- к 5¢-концу молекулы материнской ДНК, синтезируя новую цепь. ДНК-полимеразе для ра­боты нужен праймер (т.е. 3¢-ОН группа для присоединения нового нуклеотида) и матрица, детерминирующая при­соединение нужного нуклеотида. ДНК-полимеразы помимо полимеразной активности, имеют экзонуклеазную активность, они способны к гидролизу фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на не спаренном конце ду­плексной ДНК. Заодин акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3¢-конца цепи (3¢-5¢-экзонуклеаза) или с 5¢-конца цепи дуплексной ДНК (5¢-3¢-экзонуклеаза). Эти различные ак­тивности присущи разным сайтам полипептидной цепи ДНК-полимераз. 3¢-5¢-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклео­тида и удаление ошибочных нуклеотидов с расту­щего конца цепи. Все ДНК-полимеразы способы осуществлять данный тип реакции. Многие(но не все) ДНК-полимеразы обладают также 5¢-3¢-экзонуклеазной активностью. При сочетании 5¢-3¢-экзонуклеазной и поли­меразной актив­ностей происходит последовательное отщепление нуклеоти­дов с 5¢-конца одноцепочечного разрыва в дуп­лексе и удлинение цепи с 3¢-конца. В результате место разрыва пе­ремещается по цепи в направ­лении от 5¢- к 3¢- концу(так называемая ник-трансляция).

ДНК-лигазы --ферменты, осуществляющие соединение цепей ДНК, т.е. катализирующие образование фосфоди­эфирных связей между 5¢-фосфорильной и 3¢-гидроксильной группами соседних нуклеотидов в местах разрывов ДНК.Для образования новых фосфодиэфирных связей требуется энергия в форме АТФ либо НАД.

ДНК-геликазы (ДНК-хеликазы)—ферменты, осуществляющие расплетание двойной спирали ДНК. Для разделения цепей ис­пользуется энергия АТФ. Геликазы часто функционируют в со­ставе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетённых цепей. Для расплетания дос­та­точно одного геликазного белка, но длятого. Чтобы максимизи­ровать скорость раскручивания. Несколько геликаз могут дейст­вовать совместно.

Рис.2Геликазная активность белка DnaBE.coli[3].

ДНК-топоизомеразы—ферменты, изменяющие степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся перед вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что явля­ется необходимым условием для её непре­рыв­ного движения. Кроме того, топоизомеразы (типа II) обеспечивают разделение или образование катена­нов - сцеплен­ных кольцевых ДНК (образу­ются в результате репликации кольцевой ДНК), а также устране­ние узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК. Су­ществует два типа топоизомераз. Топоизомеразы типа I уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернутся вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не      требует энергии АТФ, т.к. энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в моле­куле фер­мента выступает то в роли акцеп­тора, то в роли до­нора фосфорильного конца разрезанной цепи.

Рис.3 Действие топоизомеразы I (TopoI). [3.]

       Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплиментарные цепи, пропускают двухцепо­чечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В резуль­тате за один акт снимаются два по­ложительных или от­рицательных сверхвитка. Топои­зомеразы типа II тоже ис­пользуют тирозиновые ос­татки для связывания 5¢-конца каждой разорванной цепи в то время . когда другой дуп­лекс проходит че­рез место разрыва.

              Праймаза—фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.

Рис.4 Действие топоизомеразы II: (a) образование отрицательных сверхвитков, (b) разделение и образование катенанов[3].

Репликация у прокариот.

Escherichiacoli. У этой бактерии (как и ещё некоторых исследованных видов) в области точки инициации репликации (oriC, длиной примерно 245 п.н.) находятся повторы размером в 13 и 9 пар оснований (Рис.5). При инициации 10-20 молекул белка инициации реплика­ции DnaA связывается с четырьмя девятимернымиповторами (9-mers) и расплетает ДНК в районе тандем­ного набора тринадцатимеров, богатых АТ парами (что облегчает их расплетание, т.к. между А и Т только две водородные связи). Белок DnaC доставляет шестисубъединичный белок DnaB (геликаза) к матрице. На каж­дую из одиночных цепей садится по одному DnaBи они затем двигаются в разных направлениях расплетая ДНК.

Рис.5 Модель инициации репликации в oriCE.coli.[3].

Две ДНК-полимеразыс помощью своих двух b-субъединиц прикрепляются к нити ДНК и начинают синтез ДНК. Расплетанию спирали способст­вуетSSB-белки, которые связываются с одноцепочечными участками ДНК, предотвращают образование шпи­лек и тем са­мым стабилизируют расплетённый дуплекс. Сбалансированное действие топоизомеразы II (гираза), способной индуцировать отрицательные сверхвитки(см.рис.4), и топоизомеразы I, снимающей отрицательные сверх­витки(см.рис.3) регулирует степень сверхспиральности ДНК и таким образом влияет на скорость движе­ния реп­ликативной вилки.

У прокариот обнаружено три типа ДНК-полимераз. Их свойства приведены ниже.

Свойство / тип полимеразы	I	II	III
полимеризация: 5¢-3¢	+	+	+
экзонуклеазная активность:
5¢--3¢	+	+	+
3¢--5¢	+	--	--
синтез на:
ДНК без праймера	--	--	--
одноцепочечная ДНК с праймером	+	--	--
одноцепочечная ДНК с праймером и SSB-белками	+	--	+
скорость синтеза (нуклеотиды в минуту)	600	?	30000
Табл.1 Свойства ДНК-полимераз E.coli [3]. количество молекул в клетке	400	?	10--20

IIIосуществляет удлинение лидирующей цепи, а также удлинение РНК-праймеров с обра­зова­нием фрагментов Оказаки длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. Две ДНК-полимеразы связаны между со­бой t-субъединицей. Удаление сегментов РНК с 5¢-конца каждого фрагмента Оказаки и заполнение пробелов между ними катализируетcя ДНК-полимеразой I ,способной удлинять цепь и осуществлять ник-трансляцию. Когда рас­тущий 3¢-гидро­ксильный конец каждого фрагмента Оказаки до­ходит до 5¢ –дезоксинуклеотид­ного конца соседнего фраг­мента, вступает в действие ДНК- лигаза и образуется непре­рыв­ная отстающая цепь. Роль ДНК-полимеразы II в репликации не выяснена.

   Обнаружен специальный белок терминации – Tus-белок. Он задерживает геликазу, в результатечего прекращается расплетение нити и происходит терминация репликации.

   

Рис.6 Синтез ДНК в репликативной вилке.[2]

                                                                                                                                      

Репликация у эукариот.

Как и в случае с E.coli исследованиярепликации в эукариотических клетках сначала были сосредото­чены на характеристике различных ДНК-полимераз (см. табл.2).

свойство / тип полимеразы	a	b†	d	g	e
полимеризация: 5¢-3¢	+	+	+	+	+
экзонуклеазная активность: ‡3¢-5¢	--	--	+	+	+
синтез от:
ДНК-праймера	+	+	+	+	+
РНК-праймера	+	--	--	+	?
связь с ДНК-праймазой	+	--	--	--	--
расположение в клетке:
ядро	+	+	--	+	+
митохондрии	--	--	+	--	--

                  

                    Табл.2 Свойства ДНК-полимераз клеток млекопитающих *.                        

                        *ДНК-полимеразы дрожжей аналогичны полимеразам a, b ,g соответственно

     ^{†    ДНК-полимераза наиболее активна на молекулах ДНК с брешами около 20               нуклеотидов ипредположительноучаствует в репарации ДНК}                         

                                      ^{‡   FEN1-} эукариотическая 5¢-3¢ экзонуклеаза, удаляющая РНК-праймеры; по своей

структуре и функциям она схожа с доменом ДНК-полимеразы IE.coli имеющего 5¢-3¢                         экзонуклеазную активность.[3].

Следующим этапом стало создание систем для репликации хромосом вирусов животных invitro. В ре­зуль­тате в настоящее время хромосома вируса SV40 может быть реплицирована invitro с использованием всего лишь восьми компонентов клеток млекопитающих. По своим свойствам эти белки напоминают белки необхо­димые для репликации в E.coli. Репликация ДНК эукариот также идёт в двух направлениях; для син­теза ДНК нужны праймеры синтезируемые праймазой; синтез лидирующей цепи непрерывен, а отстающей прерывистый. Как показано на рис.7, инициация репликации ДНК вируса SV40 происходит в уникальном сайте, точке начала репликации, путём связывания кодируемого вирусом белка, называемого Tantigen, или T_ag.

Этот полифункциональный белок расплетает дуплекс ДНК благодаря своей геликазной активности. Распле­тание дуплекса требует также наличия АТФ и белка репликации A (RPA), кодируемого клеткой-хозяи­ном и обладающего способностью связываться с однонитчатой ДНК (как SSB-белки в E.coli). Одна молекула ДНК-полимеразы α (Pol α) прочно связывается с праймазой и затем связывается с образовавшейся однонит­чатой ДНК. Праймаза образует РНК-праймеры, которые затем удлиняются на небольшую длину Pol α , обра­зуя пер­вую часть ведущих цепей, которые растут от точки ori в противоположных направлениях. Активность Pol α стимулируется фактором репликации C (RFC).

Затемc 3-концамb удлинённых Pol α РНК-праймеров связывается PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и замещает Pol α на обоих растущих ведущих цепях, прерывая их синтез. На следующем этапе Pol δ связывается с PCNA на 3¢-концах растущих цепей. PCNA повышает процессивность Pol δ так, что полимераза может непрерывно продолжать синтез ведущих цепей. Таким образом, функция PCNA аналогична функции β-субъединицы полимеразы IIIE.coli, т.к. оба белка образуют сходные структуры (“кольца”), охватывающие ДНК и способствующие удержанию полимераз на цепи ДНК. Они, однако, имеют различные первичные структуры; кроме того PCNA-тример, а не димер как β-субъединица полимеразы IIIE.coli.

Комплекс праймаза- Pol α. садится на цепь, являющуюся матрицей для отстающей цепи и вместе с RFC осуще­ствляют синтез запаздывающей цепи.

Наконец, как и в E.coli топоизомеразы сни­мают меха­ническое напряжение, возникающее при распле­тании ДНК в репликативной вилке, и участ­вуют в разделе­нии двух дочерних хромосом. Од­нако топои­зомеразы эукариот имеют некоторые от­личия от прокариотиче­ских: 1.топоизомеразы I эукариот взаи­модействуют с 3¢-фосфорильным концом разорванной цепи (прока­риотические --с 5¢-фосфорильным кон­цом) 2. топои­зомеразы I эукариот устраняют как отри­цательные, так и положительные сверх витки (прокариотиче­ские—только отрицательные) 3.топоизомеразы II эу­кариот не способны инду­циро­вать образование отрица­тельных сверхвит­ков (как это делает в релаксирован­ных кольцевых ДНК гираза бактерий).

Итак, получено много данных об эукариотических белках, осуществляющих репликацию ДНКвируса SV40 in vitro. Как упоминалось ранее, инициация репликации ДНК SV40 invitro требует наличие вирусного белка - T антигена. Для инициации же репликации у эукариот хромосомной ДНКнеобходим целый комплекс белков. Так, у дрожжей с сайтом ori в течение всего жизненного цикла связан комплекс из 6 разных белков (ORC), к которому в интерфазе присоединяется ещё целый ряд белков и образованный комплекс инициирует процесс репликации. Такие же белки синтезируются всеми эукариотическими клетками.

Рис.7 Модель репликации ДНК вируса SV40 invitro с помощью эукариотических ферментов.[3.]

Хромосомы эукариот линейны и их концы представлены теломерами, со­стоящими из повто­ряющихся олигомерных последо­вательностей; у человека это 25-200 копий последовательности TTAGGG. Наличие специ­альной области на концах эукариотических хро­мосом абсолютно необходимо. Дело в том, что при удалении последнего РНК-праймера отстаю­щей цепи, на 5-конце этой цепи остаётся брешь, которую не способна заполнить ни одна из ДНК-полимераз, т.к. всем им для работы необходим праймер со свободным 3-ОН концом. Без сущест­вования какого-либо специального меха­низма дочерняя нить ДНК, синтезируемая на от­стающей цепи, укорачивалась бы с каждым клеточным де­лением. Ферментом, предотвращаю­щим такое укорочение, является теломераза. Этот фермент имеет ассоциированную с ним короткую нить РНК, комплиментарную шестичленной после­до­вательности, повторяющейся в теломере и слу­жащую матрицей для синтеза ДНК теломеров. Бла­годаря этому механизму эукариотические хромо­сомы могут реплицироваться полностью. Репликация в большинство соматических клеток проходит без участия теломеразы, поэтому с каж­дым делением длина хромосом клетки укорачи­ва­ется и после определённого числа делений хромо­сомы утрачивают теломеры и начинают терять смысловые участки , что приводит к гибели клетки.Теломераза активна в половых, раковых клетках и клетках одноклеточных эукариот.

       

Заключение.

Нужно отметить, что существует ряд объектов, репликация которых проходит по несколько иному ме­ханизму, чем было описано выше. Так, например, кольцевая ДНК митохондрий и хлоропластов реплицируется с образованием D-петель (сначала начинает реплицироваться одна цепь, в результате чего об­разуется структура в форме D, а после репликации более половины первой нити, начинает синтезироваться вторая); ряд плазмид и ДНК некоторых вирусов реплицируется по типу катящегося кольца и т.п. Однако принципиальная схема репликации для всех биологических объектов остаётся одной и той же.

Литература.

1. Гены и геномы.  М.Сингер, П.Берг.   – М.: Мир, 1998. –376 с.

2. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. 
Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Watson, James D.
New York and London: Garland Publishing; c1994

3. Molecular Cell Biology. 4th ed.
Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E.
New York: W H Freeman & Co; c2000.