Серологические реакции
2СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
СЕРОЛОГИЯ - раздел иммунологии,изучающий взаимодействие АГ
и АТ в пробирочных реакциях (in vitro).
Серологические реакции - реакции с использованием АГ илиАТ
(проводящиеся in vitro).
Серологическими методами(в диагностике инфекционных заболе-
ваний) называют совокупность пробирочных реакций, основанных на
АГ-АТ-взаимодействии. /2640к/99/
1) Направленны на выявление в сыворотке крови идругихжид-
костях организма АТ к АГ возбудителей инфекционных болезней.
2) Проброчные реакции,имеющие целью обнаружение в сыворотке
крови идругих субстратахрастворимыхмикробных АГ с помощью
стандартных иммунных сывороток.
Серологические реакции проводятся с использованием
1) АГ для поиска АТ
2) АТ для поиска АГ
4+0 /?/4 IN VIVO (кожные пробы, РН in vivo ...)
4- серопрофилактика (введение АГ, АТ)
4В серологчиеские методы не входят реакции,которые ставят на
4людях или животных (реакция Шика,Дика), и серологическая иден-
4тификация культур микроорганизмов (это один из этапов бактерио-
4логического метода.
КЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
1. Двухкомпонентные
- простые (РА,РП)
-- розеточные тесты (РОК)
-- цитофлюоресцентные методы
- сложные (РН /гемадсорбции,токсина, ...,РТГА,РНГА, ре-
акция прямой имунофлюоресценции, реакции адгезии).
Реакции адгезии отличаются взаимодействием частиц, например,
клетки, с серологически активной поверхностью,в т.ч. с другой
клеткой. /2260к/
2. Трехкомпонентные
- простые
-- реакция бактериолиза,
-- реакция коагглютинации
- сложные
-- реакция непрямой иммунофлюоресценции,
-- РИА,
-- РЭМА,
-- литическиетесты (РСК,определениеАОК с помощью
эритроцитарных АГ-ов),
-- использованиеэлектронного парамагнитногои ядер-
но-магнитного резонанса) /7271/87/,
Материал для серологических реакций:
- сыворотка крови(парныесыворотки). Заморозка в течение
10-14 дней.
- ликвор,
- моча,
- фильтрат испражнений,
- промывные воды бронхов, полости рта, глотки, носа /2640к/,
желудка.
- Слизь (шейки матки, ... - здесь АТ порой больше, чем вы сы-
воротке)
Учет серологических реакций осуществляется видуально, иногда
с помощью лупы и редко - микроскопа. /2640к/99/
При оценке серологических реакций применяют 3 главных крите-
рия/2640к/99/:
- наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.),
- диагностический титр,заранее отработанный для всех забо-
леваний,
- нарастание титра АТ в течение болезни в 4 и более раза.
В процессе оценки серологических реакций часто возникает не-
обходимость дифференцировки
1) специфической реакции (на видовые и типовые антигены) от
группоспецифической (на межвидовыеАГ) [Группоспец.АГ
Salm. - табл.]
4-- дифференцировка по моноспецифическим антисывороткам,
4-- по скорости нарастания титра АТ, которая выше к специ-
4фическим АГ,0
4-- по реакции адсорбции АТ избытком антигена
4-- полегкости диссоциации ИК под влиянием диссоцирующих
4факторов0
2) ИО на текущую инфекцию от ИО на перенесенное ранее заболе-
вание и иммунизацию. /2640к/99/
5-- Оценивают по темпу нарастания АТ.
При постановке любой серологическойреакции параллельнос
опытом ставятся _контроли на каждый компонент реакции.:
- микробная культура не должна образовывать хлопья приана-
логичном встряхивании;
- сыворотка иантисывороткане должныбытьс хлопьями
(хлопьяпоявляются в процессе хранения белков в связи с посте-
пенным оголением углеводных компонентов;углеводные компоненты
белков,будучи жесткими разветвленными структурами, "запутыва-
ются друг в друге", обуславливая агрегацию белков);
- эритроциты не должны быть лизированы;
- сыворотка морской свинки,используемая как источник комп-
лемента, должна лизировать эритроциты (т.е.работать): компле-
мент + ЭБ --- лизис;
- диагностикум не должен содержать хлопьев и пр.
- при поиске АГ обязательно используется параллельномузей-
ный АГ, который должен однозначно выявляться при проведении ме-
тодики (это значит,что все компоненты реакции "работают", ме-
тодика поставлена правильно).
3РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ /РА/
РА - реакции склеивания микробов,частиц латекса или эрит-
роцитов /реакция гемагглютинации-РГА/. АГ-несущиечастицы
склеиваются антителами и выпадают в видимый осадок.
1Титром сыворотки0считают максимальноеразведение,дающее
агглютинацию АГ.
┌┐
0 0 0 0 0 = │ 0 0 │
/ / / / / / │ / / /│
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
└┘n
0 - клетка
>── - молекула антитела
1) _2Прямая РА
В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглю-
тинируют корпускулярные АГ (агглютиногены).
- 1Зернистая0 агглютинация происходит при склеивании микробов,
содержащих О-антиген.
- 1Хлопьевидная0 агглютинация происходит с бактериями, имеющи-
ми жгутики (Н-антигены).
а) 2Прямая реакция агглютинации (РА)
- _Ориентировочная РА. (на предметном стекле)
1Постановка реакции:
│Микробная суспензия
│+ антисыворотка к микробу
1Результат:0 - хлопья (агглютинаты)
5Для определениямикробного вида (серотипирования) на пред-
5метное стекло наносится 1 капля (0,05мл) диагностическойсыво-
5ротки,разведенной физиологическим раствором 1:25. На вторую
5половинустекла наноситсякапляфизиологического раствора
5(контроль).К каждой капле добавляется равный объем испытуемой
5культуры.Слегка покачивая стекло,наблюдать за течениемреак-
5ции:феномен агглютинациипроявляетсявыпадением хлопьев и
5просветлением жидкости в капле.В контроле микробнаякультура
5должна остаться мутной и гомогенной.0
- _Развернутая РА. проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного,содержащая АТ к микробу --- рас-
│ титровка
│+ микробнаясуспензия (равное количество во все про-
│ бирки или лунки
1Результат:0 - хлопья (агглютинаты) микробов
5Для определенияантител в сыворотке крови больного поста-
5вить в штатив 7 пробирок и налить в каждую из них по 0,5 мл фи-
5зиологического раствора.Добавить в первую пробирку 0,5 мл сы-
5воротки больного,разведенную в 50 раз,перемешать. 0,5 мл из
5первой пробирки перелить во вторую,перемешать; из второй про-
5бирки 0,5 мл перелить в третью и т.д. Из последней пробирки вы-
5лить для равенства объемов 0,5 мл в банку с дезраствором.В каж-
5дую пробирку добавляют по 2 капли антигена илидиагностикума.
5Оформить2 контроля - контроль антигена (для исключения спон-
5танной агглютинации) и контроль сыворотки в исходном разведении
51:50.
5Рабочая схема РА:
5──────────────────────────────────────────────────────────────
5Ингредиенты │ Ряд пробирок
5│------------------------------------------------
5│1 │2│ 3│4 │5│ 6 │ 7
5──────────────────────────────────────────────────────────────
51. Физраствор0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5
52. Сыворотка 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
5больного 1:50
5Полученные
5титры 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:50 -
53. Диагнос-
5тикум в
5каплях 2 2 2 2 2 - 2
5Инкубация в термостате 2 часа при 370С, затем при
5необходимости 24 часа при комнатной температуре.
5Учет результатов реакции проводят через 24 часа по следующей
5схеме:
5++++ полная агглютинация,жидкость прозрачная,выраженный
5осадок;
5+++ жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выражен;
5++ или+ сомнительная реакция,жидкость равномерно мутная,
5осадок отсутствует.0
5- отрицательная реакция,жидкость равномерно мутная,
5осадок отсутствует.
5Титром агглютинирующей сыворотки считается то еемаксималь-
5ное разведение,прикотором еще происходит реакция не менее,
5чем на три плюса.
5Артефакты:
5- наличие СРБ, агглютинирующегомикробы(стафилококки,
5стрептококки)
5- наличие перекрестных антигенов
б) 2Прямая реакция гемагглютинации (РГА)
- вирусами (эритроцитов любого вида животного)
- при смешивании двух разногруппных проб крови (определе-
ние групп крови)
1Постановка реакции:
│Субстанция, склеивающая эритроциты (сыворотка, вирусы)
│+ эритроциты --- хлопья
1Результат:0 - хлопья (означают присутствие АТ)
1Варианты постановки:
- _Ориентировочная РА. (на предметном стекле)
- _Развернутая РА. проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
5Материал с вирусом титруют от 1/10 до 1/1280.0,5мл данного
5материала смешивают с 0,5мл 1-2% эритроцитов. Инкубируют 30 ми-
5нут при 37оС или 45 минут при комнатной температуре. Титром ви-
5руса считается его наибольшее разведение,при котором наблюда-
5ется агглютинация эритроцитов.
5Прямая гемагглютинация, вызываемая бактериями, коррелирует с
5их способностью прикрепляться к клеткам макроорганизма, отража-
5ет вирулентные свойства. (Предложен метод селекции наиболее ак-
5тивных клеток из культуры путем их адсорбции на эритроцитахс
5последующим высевом на плотные среды.)-[11ц301-81]
2) _2Непрямая РА
= 2РНГА (РПГА0; РНГА=РПГА2) (реакция пассивной0 2или0 2непрямой ге-
2магглютинации)
1Варианты постановки:
- _Ориентировочная РА. (на предметном стекле)
- _Развернумая РА. проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
┌ ┐
│ .0. .0. │
│ / / /│
│ │ │ │ │
└ ┘n
К носителю (эритроцитам, стафилококку, частицам латекса /ла-
текс-агглютинация/ и пр.химическим способом "пришивают" анти-
гены, ампулируют и выпускают в биотехнологической промышленнос-
ти как диагностикумы.
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного --- раститровка
│+ диагностикум в каждую лунку ---
1Результат:0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),
- "пуговка" (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-
ет титр АТ.
5Сорбция наносителе либо АГ (РНГА=РПГА),либо АТ (обратная
5РПГА).
5Реакция ставится в двух вариантах.Антиген (РПГА) или анти-
5тела (РНГА) связываются с крупным носителем с последующим выяв-
5лением уровня специфических иммуноглобулинов или антигена.
5Исследуемый антиген"сшивается"танином или глютаровым ди-
5альдегидом с эритроцитами или частицами латекса.
5Сыворотка больного, прогретая 30 минут при 56оС, раститровы-
5вается (0,5мл)и смешивается с 2 каплями эритроцитарного диаг-
5ностикума.
3) _2Проба Кумбса.0 (непрямая пассивная гемагглютинация;
антиглобулиновый тест)
Для постановки этой реакции необходима антиглобулиноваясы-
воротка, которуюполучают путем иммунизации кролика иммуногло-
булинами человека.
Используется для определения неполных (функционально однова-
лентных)антител, например,"ро"-антител к эритроцитам плода
при резус-конфликте, ряд аутоантител, АТ к некоторым микробам и
пр. Эритроциты плода в условиях in vivo не агглютинируют, одна-
ко при обработке их in vitro антисывороткой к гамма-фракции ан-
тител человека происходит РА на стекле (=_ориентировочная.реак-
цияКумбса). К сыворотке добавляется антиген (резус-фактор) и
затем антисыворотка против гамма-глобулинов, что вызовет агглю-
тинацию загруженных эритроцитов. _Развернутая. реакция Кумбса (в
ряду пробирок или лунок) применяется для определения титра цир-
кулирующих неполных антител в сыворотке больного.
┌ ┐
│ 0 0 │
│ / / / / -АТ410│
│ │ │ │ │ │
│ / / /│
│ │ │ │ │
│ АТ420 АТ420 АТ420 │
└ ┘n
1Постановка реакции:
│Сыворотка (АТ410) --- раститровка
│+ эритроциты (с Rh-антигеном)
│+ антисыворотка к Fc-фрагментуIg G (АТ420).
1Результат:0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),
- "пуговка" (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-
ет титр АТ.
4) _2Реакция коагглютинации0 2(РКОА0, РКА2)
1Варианты постановки:
- _Ориентировочная РА. (на предметном стекле) --- хлопья
- _Развернумая РА. проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
L[+]
┌ │ ┐
│ ┌─┴─┐4 0 │
│ 0>4──0┤St.├4─0─<0│
│ └─┬─┘4 0 │
│ │ │
└ ┘n
К носителю - клеткам инактивированного золотистогостафило-
кокка(Staphylococcusaureus), несущего на своей поверхности
белок А (функциональный аналог FcR) добавляютнеобходимыеАТ
(антисыворотку)и послеинкубации- исследуемую жидкость с
предполагаемыми АГ-ми.
1Постановка реакции:
│Стафилококковый диагностикум
│+ АГ
1Результат:0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),
- "пуговка" (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-
ет титр АТ.
5Реакция Ко-агглютинации(РКА) предложена в 1973г.Kronvall
5для постановки диагноза пневмококковой инфекции. Сейчас она ис-
5пользуется для диагностики эшерихиозов,коклюша, менингококко-
5вой, стрептококковой инфекции,сальмонеллезов и шигеллезов,а
5также для обнаружения некоторых бактериальных токсинов.
5/2119к/85/
5Реакция пригодна для идентификации различных антигенов путем
5агглютинации стафилококков, сенсибилизированных антителами про-
5тив детерминант бактериальной, вирусной или неинфекционной при-
5роды. /2111к/
5Например, дляиндикации шигелл зонне в молоке,кефире и в
5материалах от людей.Для определения чувствитель-
5ности РКОА ставили с 10-кратными разведениями 1 млрд. микробной
5взвеси шигелл Зонне.Чувствительность РКОАсоставила 108-109
5микробных тел в 1 мл взвеси. /2111к/
5Стафилококковый реагентвыпускается Ленинградским НИИЭМ им.
5Пастера ииспользуется его 2%взвесь. Для сенсибилизации ис-
5пользуются сыворотки с титром антител в РПГА не ниже1:12800.
5/2111к/
5На предметное стекло капают 2 капли по 0,1 млдиагностикума
5и испытуемый материал.Положительным результатом считалось об-
5разование агглютината с полным просветлением смеси. (Контроль -
5с физраствороми реакция с заведомо инфицированным материалом.)
4Определение энтеротоксина в реакции
4коагглютинации
4Культуру сальмонелл осаждают(8000 об./мин.;20минут),к
4осадку микробов добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, готовят
4лизат, вновь центрифугируют (8000 об./мин.;20 минут) и снадо-
4садком (супернатантом) проводят реакцию. /1804к/88/
4В реакции используют диагностикум - золотистый стафилококк с
4"пришитыми" к нему антителами к токсину. 2-3 капли реагента + 1
4капля супернатанта культуры сальмонелл больного --- РА(оценка
4+, ++, +++, ++++ после 3-минутного покачивания). /1804к/88/
5) _2РТГА (реакция торможения гемагглютинации)
Гемагглютинин (НА) вирусов заблокированантителами (первые
ячейки с "_пуговками." = РА нет):
L[+]
┌ ┐
│ ┌───┐ ┌───┐ │
│ ──<0>── │Эр.│ ──<0>── │Эр.│ ──<0>── │
│ └───┘7 0└───┘ │агглютинации
└ ┘эритроцитов
нет
0 - вирус (=торможение
>── - антитела агглютинации)
При "следовых" количествах антител к гемагглютитину (НА) или
их отсутствиигемагглютинин("клей для эритроцитов") вирусов
остается "открытым" (не закрыт антителами) и происходитсклеи-
вание эритроцитов (последние ячейки с "_зонтиками." = РА есть):
L[+]
┌ ┐
│ ┌───┐ ┌───┐ │
│0│Эр.│0│Эр.│0│
│ └───┘ └───┘ │
└ ┘n
а) Определениетитра АТ к определенному вирусу (добавляется
антисыворотка к НА /гемагглютинин видоспецифичен/ данного виру-
са).
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного --- раститровка
│+ суспензия музейных инактивированных вирусов
│ (или диагностикум)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат:0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть, АТ нет
- "пуговка" (РА нет, АТ есть
Последняя ячейка с положительной пробой ("пуговкой") означа-
ет титр АТ.
б) Определение типа вируса,допустим, гриппа (А, А или С) у
больного по выделенной культуре
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологической планшете:
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа А --- раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа В --- раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа С --- раститровка
│+ Вирус-содержащий материал от больного (культура, но-
│ совая жидкость) во все 3 ряда
│ (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,
│ если нужно сориентироваться в количестве вирусов)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат:0 - ряд с "пуговками"означает тип вируса.
5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) - 0,25мл;
5- добавляется вирус в четырехкратном титре (разведениев4
5раза от исходного титра)
5- инкубируют 30 минут при 37оС
5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов
5- инкубируют 30 минут при 37оС или 45минут прикомнатной
5температуре.
в) Определение типа вируса,допустим, гриппа (А, А или С) у
больного по наличию антител в сыворотке крови
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологической планшете:
│Сыворотка больного --- раститровка в 3 рядах
│+ Музейный вирус типа А (в первыйряд)
│+ Музейный вирус типа В (во второй ряд)
│+ Музейный вирус типа С (в третийряд)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат:0 - ряд с наибольшим количеством "пуговок" означает
наибольший титр АТ у больногокданному типу
вируса,что предположительноговорит о соот-
ветствующем гриппе (для доказательства оценива-
ют титрАТ в динамике с интервалом в 2 недели;
при увеличении титра минимум в 4 раза можно го-
ворить об острой инфекции и соответствующем за-
болевании).
3РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ
Реакции иммобилизацииоснованы на способности специфических
АТ,циркулирующих в сыворотке больных,подавлять подвижность
различных микроорганизмов.
На практике нашли применение реакциииммобилизации бледной
трепонемы и холерного вибриона.
3РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)
- реакции взаимодействия между антигеном и антисывороткойс
образованием видимого"осадка" (преципитата) - преципитирующих
иммунных комплексов (ПИК).5МАТ (моноклональные АТ) одновалент-
5ные, поэтому в РП пока не используются.0
┌───────────────── РП ────────────────────┐
_В жидкой фазе. _В агарозе. (1%)
- реакции кольце- - в т.ч. электрофоретические
преципитации (в этом случае агароза варится
- нефелометрия на веронал-мединаловом буфере
(ВМБ, рН 8,6)
Механизм взаимодействия антигенов и антител:
АГ │ АГ=АТ │ АТ
(пропорциональное
количество АГ и АТ;1:1)
│ │ │ │ │ │ │
│ │
┌───┐ о о │ / / / / / │ Y Y ┌───┐
│АГ │ о о │ о о о о о │ Y Y │АТ │
└───┘7 0 о │ / / / / /│Y└───┘
о о│ │ │ │ │ │ │ Y
ПИК
(преципитирующие ИК,
преципитат)
1) _2Реакция кольцепреципитации
│─│
│ │- АГ
│ │
│=│- зона преципитации (помутнения) в пробирке или капилляре
│ │
│ │ - Антисыворотка
└─┘
а) _Определение С-реактивного белка. (СРБ): капилляр наполови-
ну заполняют антисывороткой к СРБ и дополняют сывороткой боль-
ного. Капилляр вставляют в пластелиновую пробку и оставляют до
утра.Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии
СРБ в кровотоке (количество СРБпропорциональноинтенсивности
деструктивных процессов в организме).
5Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-
5не0ц5 треть- исследуемой сывороткой.Капилляр покачивают 12-15
5раз для смешивания ингредиентов и устанавливают вертикальнона
5пластилиновый штатив.оставляют 24 часа при комнатной темпера-
5туре. Помутнение на границе раздела свидетельствует оналичии
5СРБв кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности
5деструктивных процессов в организме).
5Результат оценивают по высоте преципитатавкапилляре.
б) _Диагностика сибирской язвы
Прокипяченый инфицированный материал
+ антисыворотка (медленно наносить;по стенке пробирки сте-
кает под слой АГ)
Инкубация несколько минут. Зона помутнения свидетельствует о
присутствии АГ в материале.
2) _2Нефелометрические, тербидиметрические методы
Принцип нефелометрии заключается в измерении количества све-
та, рассеиваемого частицами (ПИК) в жидкой среде.Длянефело-
метриоптимальны растворынизкойконцентрации (в отличие от
турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концент-
рации,поскольку вэтом случае измеряется потеря проходящего
света).
5Чувствительность метода - 100 мкг/млантителили антигена
5при исследованиицельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании
5чистых растворов.Данным методом можно проводить до 120 анали-
5зов вчас. Времяобразования ИК можно значительно сократить,
5если ее проводить в 4% полиэтиленгликоле с М. 6000Д.
3) _2Метод преципитации в геле по Оухтерлоню
Стекла или чашки Петри заливают 1-2%агаром илиагарозой.
После застывания агара вырезают по трафарету лунки. В одни лун-
ки вносят исследуемые сыворотки (препараты), в другие, располо-
женные напротив - соответствующие антисыворотки. Пластины инку-
бируют во влажной камере в течение 24-48 часов.
Варианты постановки:
- 2 лунки (диаметром 3-5 мм) на расстоянии 3-5мм другот
друга (одна с АТ, другая с АГ);
- в центре лунка с антисывороткой,вокруг лунки сразными
пробами АГ-содержащего материала (или наоборот, в центре - АГ,
по периферии - АТ);
- бороздка (или полоска пропитанной фильтровальнойбумагой,
наложенной на агарозу) с антисывороткой (АТ-ми), по бокам лунки
с АГ или бляшкимикробов,синтезирующих токсин(определение
токсигенности дифтерийной палочки).
4) _2Метод преципитации в геле по Манчини
_2(метод радиальной иммунодиффузии - РИД)
/ ---- зона преципитации
│о--│---- лунка с точно дозированным количеством
4---0/ сыворотки
Метод количественного определения антигенов основан на изме-
рении диаметра кольца преципитации,образующегося при внесении
исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в кото-
ром предварительно диспергирована моноспецифическаяантисыво-
ротка. Вслое агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм
на расстоянии 15мм одна от другой.В лунки первого ряда вносят
с помощьюмикрошприца по 2мкл антигена (или стандартной сыво-
ротки) в разведениях 1/1,1/2, 1/4, 1/8. Лунки следующих рядов
заполняютсяиспытуемыми препаратами.Пластиныинкубируют во
влажной камере в течение 24 часов (пластины с анти-Ig Mсыво-
роткой-48 часов).По окончании инкубации измеряют диаметры
колец преципитации.Концентрацию антигена определяют по калиб-
ровочной кривой.
Например, определение концентрации Ig M,G,A в сыворотке кро-
ви больных.
5) _2Ракетный электрофорез0 2(электроиммунодиффузия)
1/4 о=== о - лунки с точно дизированным
1/2 о====== количеством сыворотки
1/1 о========== === - зоны преципитации
2- + 0 (измеряется длина зон, мм)
Катод Анод
1/1, 1/2, 1/4 - разведения стандартной сыворотки (т.е.
сыворотки с известным количеством антител)
Ставятся для построения калибровочной кривой.
В 1966г. Laurell разработал метод, сочетающий иммунодиффузию
с электрофорезом.Антиген движется в геле агарозы,содержащем
антисыворотку.Для электрофоретическихреакцийпреципитации
агарозу расплавляют в веронал-мединаловом буфере (рН 8,6) в во-
дяной бане,остужают до 525о0С, смешивают с антисывороткой и за-
ливают на стекло.
После застывания(через 5 минут) вдоль кромки слоя геля де-
лают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. В слое
гелясоздают электрическоеполе,благодаря которому антиген
входит в гель. Зона преципитации приобретает вид "ракеток". Вы-
сота "ракеты", образующейся в результате реакции, прямо пропор-
циональна концентрации антигена (она измеряется от верхней гра-
ницы лунки до высоты пика).
6) _2Противоточныйили встречный электрофорез.0 (экспресс-диаг-
ностика вирусных и др. инфекций)
4Встречный ИЭФ(иммуноэлектрофорез)был применен Бендарид в
41969г. Электрическое поле усиливает способность квзаимодейс-
4твию низкореактогенныхАГи АТ. Чувствительность метода в 10
4раз превышает чувствительность метода двойной иммунодиффузии по
4Оухтерлони. /2400к/
Основное условие метода - наличиеэлектрофоретическойпод-
вижности АГ.
┌─────────────────────────────────┐
2-0 │ 0 │ 0 0 │ 2+
Катод │ АТ АГ АТ │ Анод
│ ПИК │
└─────────────────────────────────┘
В две лунки геля заливают антиген и антитела,пластину ста-
вят в камеру для электрофореза и включают напряжение. Электри-
ческим полем значительно ускоряется движение компонентов и ре-
акция преципитации проходит за 30-40 минут. Экспресс-диагности-
ка
7) _2Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)
┌───────────────────────────────────────┐ +
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ ██ █ █ █ █ █ │
│ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
└───────────────────────────────────────┘ -
1Постановка реакции:
│- В лунки заливается исследуемая смесь веществ,
│ пластина с агарозой ставится в электрофоретическую камеру
│ на ночь для разгонки белков.
│- Вынимается агароза из бороздок. В них заливается антисыво-
│ ротка (удобнее чередовать антицельную сыворотку с моноспе-
│ цифической к искомому компоненту). Ночь во влажной камере.
1Результат:0 оценивается степень чистотыпрепаратапо коли-
честву "лишних"дуг зон преципитации примесей с
антицельной сывороткой (если препарат получали из
крови).
5В геле,приготовленном наверонал-мединаловомбуфере (рН
58,6), потрафаретуделаются бритвой полоски и лунки. Гель из
5лунок вынимается (из бороздок нет) и лунки заполняют смесью ан-
5тигенов или исследуемой сывороткой.Пластина ставится в прибор
5для электрофореза и в течение ночи проводится разгонка исследуе-
5мых белков.На следующий день освобождаются от геля бороздки и
5заполняются моноспецифическими и полиспецифическими (часто ан-
5тицельной) антисыворотками.Пластинаоставляется наночь во
5влажной камере для реакции преципитации.
58) _Перекрестный электрофорез
5Смесь исследуемыхбелков разгоняетсяпоперекпластины в
5электрическом поле, затем к полоске геля с разделенными белками
5приливается расплавленныйгельс антисывороткой к исследуемым
5компонентам и разгонкапроводитсяв продольномнаправлении.
5Формируются широкиеотдельныезоны преципитацииисследуемых
5компонентов белков.
3РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ
┌┐
│ 0 0 │ - хлопья флоккулята
│ / / /│ (помутнение в пробирке)
│ │ │ │ │
└┘n
0 - молекула антигена (токсина или др.)
>── - молекула антитела
5В результате взаимодействия токсина или анатоксинасанти-
5токсической сывороткойвыпадаютхлопья флоккулята.Наиболее
5ранняя флоккуляция наблюдается в пробирке,где антиген и анти-
5тело содержатся в эквивалентных соотношениях.
5Одна флокуллирующая единица токсина (Lf - Limes flocculatio-
5nis) в 1 мл определяется минимальным количеством токсина,даю-
5щим начальную флоккуляцию с 1 международной единицей (МЕ) сыво-
5ротки.
52мл токсина (20 Lf в 1 мл) смешивают в пробиркахсразными
5количествами сыворотки (0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл), инкубируют
530 минут при 45оС до выпадения хлопьев в однойизних. Если
5флоккуляция произошла в 3 пробирке,значит,в 0,4мл сыворотки
5находится 40МЕ. Следовательно, 1мл сыворотки содержит
540:0,4=100 МЕ.0
3РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ
(ИФМ - иммуно-флюоресцентный метод)
1) _Прямойметод. иммунофлюоресценции(по Кунсу) основан на
взаимодействии антител,меченых флюорохромом, с антигеном, ко-
торый находится на клетке, в клетке или в тканях.
В качествефлюорохромаиспользуют
- флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ),дающий зеленое свечение в
УФ-ых лучах;
- тетраметилродаминизотиоцианат(ТРИТЦ) с оранжево-красным
свечением. /2551к/
┌────────────────────────┐ 4Y
│ 1┌┬┬┐0 │ │ - АТ
│ 1└┴4Y1┘0 │ * - метка флюорохрома (светя-
│ │* │ щаяся в темном поле зрения
└────────────────────────┘ люминесцентного микроскопа)
Предметное стекло с препаратом
4(после промывки от несвязавшихся АТ)
1Постановка реакции:
│Фиксированный мазок
│+ диагностическая сыворотка с АТ-ми, мечеными ФИТЦ.
│Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия(при положительномрезультате
│ видно свечение.
5Материал (препарат ткани,микроорганизмов или антигена) на-
5носится на стекло,фиксируется 15 минут в спирте или в пламени
5горелки, обрабатывается флуоресцирующей сывороткой (15-30 минут
5при комнатной температуре),промывается 15 минут физиологичес-
5ким раствором;проводится люминесцентная микроскопия.Отсутс-
5твие свечения свидетельствует об отсутствии антигена напрепа-
5рате.
5Для получения флуоресцирующих антител к растворуиммуногло-
5булинов добавляют растворфлуоресцетинаизотиоцианата натрия
5(можно 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид и изотиоцианат
5лизамин родамина В 200).
2) _Непрямой метод
┌────────────────────────┐ 4Y0 >─── - АТ420 (меченые
│ 1┌┬┬┐0 │ │ - АТ410 флюорохромом)
│ 1└┴4Y1┘0 │ * - метка флюорохрома
│ │>───* │
└────────────────────────┘
Предметное стекло с препаратом
4(после промывки от несвязавшихся АТ)
1Постановка реакции:
_1 вариант
│Фиксированный мазок больного (микробы больного)
│+ _диагностическая сыворотка. (обычные АТ; первого порядка),
│ допустим, кролика.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов кролика с АТ-ми
│ (второго порядка), меченными ФИТЦ.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия(при положительномрезультате
│видно свечение.
_2 вариант
│Фиксированные мазки музейных микробов (диагностикума),
│+ (раститрованная) _сыворотка больного
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов (АТ второгопоряд-
│ ка), меченными ФИТЦ.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия(при положительномрезультате
│видно свечение.
5Антисыворотку киммуноглобулинам кролика получают иммуниза-
5цией барана иммуноглобулинами кролика.
5Метод иммуннойфлюоресценции применяютдляидентификации
5риккетсий и других бактерий,вирусов,а также для определения
5рецепторов и АГ-ов животных клеток человека и животных.
3ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)
ELISA-МЕТОД=РЭМА
(Enzyme-linked immunosorbent assay =
реакция энзим-меченных атомов)
5Метод независиморазработали вначале 70-х годов шведские
5исследователи Энгвалл и Перлманн, голландские ван Веемен и Шуур
5и американские исследователи под руководством Рубинстайна.
К настоящему времени созданы многочисленные модификацииба-
зовой методикии наибольшее распространение получил гетероген-
ный ИФА на твердой фазе (_твердофазный ИФА.).КоммерческиеМАТ
(или АГ) фиксируют на лукнах пластиковых панелей,реже иммоби-
лизуют на бусах или нитроцеллюлозных мембранах. /2400к/
Лунка иммунологическойпланшеты с"пришитыми"антигенами
(диагностические планшеты)
│ │
│ │>── - АТ410 (антитело первого порядка)
│АГ>──4Y0 │4Y
│ │* ││ - АТ420 (молекула АТ второго порядка,
│ │меченая пероксидазой хрена)
└────────────────┘* - пероксидаза (ПХ) хрена
Н420О42 ───── 0Н420О + [O]
5ПХ0 радикал кислорода
+ раствор Н420О420 и красителя (хромогена),
изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода (орто-фе-
нилендиамин) --- спектрофотометрия (под вертикальным лучом)
После каждогоэтапа обработки планшета промывается физраст-
вором или буфером.
5ИФМ можно определить белки,содержащиеся в количественес-
5кольких нанограммов в 1 мл. В качестве ферментных меток исполь-
5зуют пероксидазу хрена,глюкозоксидазу, бета-галактозидазу или
5щелочную фосфатазу.0
5Этапы:
5Первым этапомявляется связывание моноспецифических антител
5(или антигена,если искомым белком является антитело) на твер-
5дом субстрате, обычно на стенках пластиковой пробирки или план-
5шеты. Связывание происходит путем физической адсорбции белка на
5гидрофобной поверхности.0
5- Полистироловая(полистереновых)планшетка обрабатывается
5антигеном для их сорбции (или антителами).
5- Добавляется альбумин (забиваются все свободные сайтысвя-
5зывания, чтобы не было затем неспецифической сорбции антител).0
5- Обработка антителами или сывороткойбольного,содержащей
5предполагаемую разновидность антител.
5- Добавляется антисыворотка,меченная ПХ (пероксидазой хре-
5на).
5- Приливается реактив АВТSили др.,которыйокрашивается
5после воздействия пероксидазы. Можно использовать смесь переки-
5си водорода и хромогена (ортофенилдиамина, изменяющего окраску
5в зависимости от количества радикальных форм кислорода от свет-
5ло-желтой до коричневой).
5- О наличии и количестве АТ судят по изменению цветаиин-
5тенсивности окраскираствора.Измерение интенсивности окраски
5на спектрофотометре /СФ/.0
5[ИФМ можно проводить двумя путями - по непрямому (описанному
5выше) и конкурентному типу.В первом случае конкурентные отно-
5шения отсутствуют: исследуемая биологическая жидкость реагирует
5с твердофазными антителами,после чего на удаляется из и в ре-
5акцию вводят меченые ферментомантитела,которые связываются
5ужеиммобилизованнымантигеном. В этом случае ферментативная
5активность прямо пропорциональна количеству антигена в исследу-
5емом материале.Во втором случае антиген,меченный ферментом,
5конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за выделенные на
5твердой фазе антитела, и ферментативная активность обратно про-
5порциональна количеству антигена в исследуемом образце.]
5В качестве твердой фазы используют вещества различного хими-
5ческого состава -полистирен,полипропилен, поливинил,гели
5декстрана, агарозы,полиакриламида, целлюлозы, нитроцеллюлозы,
5нейлон.
3РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД /АНАЛИЗ/ (РИМ=РИА)
РИСТ - радиоиммуносорбентный метод
Ставится аналогично ИФА,но с использованием антител, мече-
ных радиоактивным изотопом.
│ │
│ │>── - АТ410 (антитело первого порядка)
│АГ>──4Y0 │4Y
│ │* ││ - АТ420 (молекула АТ второго порядка,
│ │меченая изотопом)
└────────────────┘* - радиоактивная метка --- счетчик
радиоактивности
Работа проводится в радиоизотопных лабораториях.
Используются антитела,меченные радиоактивным элементом-
иодом (51250I,51310I) или др. - с последующим измерением радиоак-
тивности.Если предыдущиеиммунохимическиеметоды способны
улавливатьконцентрацию белка не ниже 1 мкг/мл,то с помощью
РИМ можно определить концентрации,измеряемыев пикограммах,
поэтомуметод РИА считается одним из подходящих количественных
методов иммунохимического анализа.
Учет реакции проводятпо убыванию или по возрастанию ради-
оактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специаль-
ных счетчиков бета- или гамма-излучения. Метод высокочувствите-
лен, но постепенно вытесняется иммунофлюоресцентныманализом.
/2551к/
3ИММУНОБЛОТТИНГ
и дот-микросвязывание
1Постановка методики:
│- Вертикальный электрофорез пробы в течение ночи
│- Снятие отпечатка на нитроцеллюлозную бумагу (полоски
│ или цельную)
│- Инкубация полосок бумаги в растворе антисыворотки к иско-
│ мому антигену. Промывка от несвязавшихся АТ.
│- Инкубацияв растворе противовидовой антисыворотки (раст-
│ воре АТ второго порядка), меченых ПХ (пероксидазой хрена)
│- + раствор Н420О420 и красителя,изменяющего цвет в присутс-
твии радикалов кислорода. Присутствие АГ расценивается по
наличию окрашенных красителем пятен на бумаге.
5Метод основан на разделении полипептидов в ПААГ (полиакрила-
5мидном геле)и анализеразделения иммунохимическими методами
5после переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану,
5на которой белки доступны для любого вида твердофазного иммуно-
5анализа (иммуноферментного или радиоиммунного).
5Этапы:
51. Электрофорез исследуемой смеси пептидов и маркеров сиз-
5вестной молекулярной массой в ПААГ.
52. Окраска геля нитратом серебра.
53. Перенос следов белка на нитроцеллюлозную бумагу или мемб-
5рану наосновенейлона (отпечаток геля) с получением реплики
5электрофореграммы. Процесспереносаназывается блоттингом,а
5полученный отпечаток - блотом или блотограммой.0
54. Обработкабумаги в полиэтиленовом пакете в антисыворотке
5к исследуемым антигенам. Промывка.
55. Обработка антителами к фракции иммуноглобулинов,связан-
5ных с пероксидазой или с биотином (ИФМ).
56. Окраска авидин-пероксидазой или диаминбензидином с добав-
5лением перекиси водорода. Промывка. Высушивание.0
.
3РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ /РН/
_21) РН вирусов в цветной пробе (в культуре ткани).
Допустим, у больного грипп типа В:
│ │ │ │ │ │
│ │ │РН │ │ │
├───┤ ├───┤ ├───┤
│ В │ │ В │ │ В │
└───┘ └───┘ └───┘
+ АТ к А + АТ к В + АТ к С
(+ антисыворотка- " - (+ антисыворотка
к вирусу типа А) │ к вирусу типа С)
│
Во второй пробирке
произойдет нейтра-
лизация вируса (РН).
Добавленные клетки
останутся живыми.
1Постановка методики:
│Вирусная культура
│+ антисыворотка к белкам адгезии вирусов (НА)
│ --- инактивация вируса (неспособность проникатьв клетки
│ для репродукции)
│+ культура клеток --- гибели нет (метаболизм клеток продол-
│ жается, среда закисляется и окраска среды 199 меняется на
│ желтую.
При выявлении одного,допустим, из 3 типов вирусовгриппа
(А,В,С) в 3 пробирки добавляют исследуемую культуру вируса (ал-
лантоисную жидкость куриного эмбриона), затем в каждую пробирку
свою антисыворотку (против А,против В, против С) и после пре-
динкубации - культуру клеток в среде 199. В двух из трех проби-
рок АТ не свяжут вирусы,вирусы проникнут в клетки; клетки по-
гибнут, метаболизм прекратиться (среда перестанет желтеть и ос-
танется исходной - малиновой).
_22) РН вирусов в культуре ткани.0 или курином эмбрионе по нейт-
рализации ЦПД.
Ставится аналогично, но наблюдается не изменение цвета пита-
тельной среды, а (чаще под микроскопом) отсутствие ЦПД (цитопа-
тогенного действия вируса) - образование многоклеточного синци-
тия, гигантских многоядерных клеток, появление включений, вези-
куляция клеток и пр.
_23) РН токсина антитоксической сывороткой
а) in vitro
- Реакция флоккуляции (хлопьеобразования)
б) in vivo
1- 0Например,определение типа токсина Clostridiumbotulinum
при ботулизме.Клостридииботулизма способны продуцировать 7
серотипов токсина - А,В,С,D,E,G,F,из которых внашей стране
встречаются чаще токсин типа А, типа В и типа Е.
Допустим, человек отравился токсином Е:
│ ││ ││ │
│ ││ ││ РН│
├───┤ ├───┤├───┤
│ Е ││ Е ││ 2Е0 │
└───┘ └───┘└───┘
+ АТ к А + АТ к В + АТ к 2Е
│ │ │
мышь погибнет мышь погибнет мышь выживет
Токсин-содержащий материал разливают по 3 пробиркам и добав-
ляют в первую - антисыворотку к токсину А,
во вторую - антисыворотку к токсину В,
в третью - антисыворотку к токсину Е.
В 3 пробирке произойдет образование ИК, т.е. нейтрализация ток-
сина (РН). Для выявления данной пробирки содержимое вводят трем
мышкам. Третья мышь выживет.
1Минимальной летальнойдозой токсина0считаетсяколичество
токсина. которое при подкожном введенииморскойсвинке весом
250г вызывает ее гибель в течение 4-5 дней.
4) Феномен гашения сыпи (in vivo), например, при диагностике
скарлатины.
Для диагностики скарлатины в область наиболее обильнойсыпи
вводят антисывороткук эритрогенному токсину;если у больного
скарлатина, то сыпь в месте инъекции пропадает.
5) РН для определения напряженности антитоксического иммуни-
тета к дифтерийному токсину (проба Шика), скарлатинозному ток-
сину(проба Дика) в здоровом организме.
В область предплечья внутрикожно вводятопределенное коли-
чество соответствующего токсина (1/40 DLM).При наличии в ога-
низме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина иреакция
будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов (антитоксичес-
ких АТ) в организме возникает воспалительная реакция (покрасне-
ние) на месте введения токсина. /2551к/
Подкожное введение эритрогенного токсина иммунным лицам при-
водит к нейтрализации токсина (покраснения не будет).
3РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)
_5Реакции иммунного лизиса. используются в нескольких вариантах
51) Для определения АТ к эритроцитам барана (ЭБ)
52) Для определения HLA на В-лимфоцитах (лимфоциты+МАТк
5определенному АГсистемыHLA+ комплемент --- лизис клеток +
5гемсистема - ЕА (эритроциты /Е/ барана,нагруженные антителами
5/А/ к ним /ЕА/). 6-12 ячеек из 100 будут с целыми эритроцитами,
5остальные - с лизированными (ИК нет, нет активации комплемента,
5нетпотребления комплемента,свободныйкомплемента лизирует
5ЭБ). РСК.
53) Для определения титра АТ к любому АГ (РСК).
4В реакциях иммунного лизиса специфические АТ взаимодействуют
4с различными клетками,в том числе с бактериями и простейшими,
4чтоприводит к активации системы комплемента по классическому
4пути и последующему лизису клеток.Среди них известныреакции
4гемолиза и вибриолиза. /2400к/98/0
5Реакция гемолизасчитается активной при использовании АТ к
5эритроцитам барана. При пассивной реакции иммунного лизиса про-
5изводятадсорбцию антигена на эритроцитах барана с последующим
5добавлением искомых антител к АГ-ну и комплемента.0
2Определение титра антител по РСК
2(реакции связываниякомплемента)
1/10 1/1005 01/10005 и т.д. (раститровка)
= 105-10 = 105-2 0 105-30 5 0105-40 105-50 105-60 105-70 5 0 105-7
│ ││ │ │ ││ ││ │ │ ││ ││ │ │ │
│ ││ │ │ ││ ││ │ │ ││ ││ │ │ │
├───┤├───┤├───┤├───┤├───┤├───┤├───┤├───┤├───┤
│ о ││ о ││ о ││ о ││ - ││ - ││ - ││ - ││ │
└───┘└───┘└───┘└───┘└───┘└───┘└───┘└───┘└───┘
________________________/_________________________/ Контроли
Эритроциты барана целы Эритроциты барана лизированы
(муть или осевшие на дне)
1Постановка методики:
│- Раститровка сыворотки для определения титра АТ
│+ АГ (музейная культура микробов, лекарственный препарат,
│ анатоксин и пр. --- ИК в первых пробирках по убывающей
│+ комплемент (сыворотка морской свинки) --- связывание ИК с
│ C1q.Инкубация 15 минут.
│+ ЕА (гемсистема;другой вид ИК). Инкубация 15 минут.
│ --- Лизиса в первых пробирках нет, т.к. C1q весь связан с
│ первым типом ИК.
┌────┐ ┌────┐
│ АГ │ │ ЭБ │
└──┬─┘ ┌────┐ └──┬─┘
├────┤ С│ │ --- гемолиза эритроцитов нет
┌──┴─┐ └────┘ ┌──┴─┐ (положительная РСК)
│ АТ │ │ АТ │
└────┘ └────┘
ИК ИК [С- комплемент]
┌────┐ ┌────┐
│ АГ │ │ ЭБ │
└────┘ ┌────┐└──┬─┘
│ С ├─────┤ --- гемолиз эритроцитов
┌────┐ └────┘┌──┴─┐ (отрицательная РСК)
│ АТ │ │ АТ │
└────┘ └────┘
ИК нет или мало ИК
(антител к искомому
АГ нет или мало)
1Примечание0:
- Сыворотка больного предварительно инактивируется от собс-
твенного комплемента (565о0 20 минут), поскольку активность комп-
лемента у разных больных разная (сбои в результатах).
- Предварительно отрабатывается рабочая доза АГ (не влияющая
сама по себе на реакции активации комплементарного каскада).
- Подбирается рабочая доза комплемента (избытокнедопустим,
так как C1q будет оставаться и на ИК второго порядка).
51. Приготовление 5% суспензии эритроцитов барана (Е):
50,5 мл осадка отмытых эритроцитов + 9,5 мл физраствора.
52. Определениетитра гемолитическойсыворотки(антител /А/
5к эритроцитам барана):
5Титром гемолитической сыворотки считается максимальноераз-
5ведение в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз
50,5мл 3%взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5мл компле-
5мента (1:10).Пробы выдерживаются при температуре 370С в тече-
5ние 1 часа.
53. Приготовление рабочего растворагемолитическойсыворотки
5(1:3):
5Например, исходный титр 1:2700;2700 : 3 = 900, т.е. сыво-
5ротку необходиморазвестив 900 раз (взять 1/900 часть от ко-
5нечного объема).Если надо10 мл гемсистемы,то нужно взять
510:900=1/90мл=0,011мл исходной гемолитической сыворотки.
54. Приготовление гемолитической системы (индикаторной систе-
5мы для комплемента):
5Смешиваются равные объемы 5%суспензии эритроцитов барана и
5гемолитической сыворотки(1:6);при этом сыворотка при непре-
5рывном встряхивании выливается в суспензию эритроцитов,ане
5наоборот. Смесь встряхивается 5 минут и инкубируется 30 минут в
5термостате. Отмывается.
55. Определение рабочей дозы комплемента:
5В качестве источника комплемента можно использовать сыворот-
5ку здоровых доноров (при этом комплемент сыворотки инактивиру-
5ется прогреванием в течение 30 минут при 560С) или лиофилизиро-
5ванную сыворотку морской свинки.
5Титр комплемента - то наименьшее количество комплемента, ко-
5торое будучи смешаннымс0,5мл гемолитическойсыворотки(в
5трехкратном титре),гемолизирует 0,5мл 3% взвеси эритроцитов в
5течение 30 минут.
5Для титрованияпользуются основным разведением комплемента
51:10 и разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5мл. Затем в каж-
5дую пробиркудобавляют физраствор до 1,5мл и 1 мл гемолитичес-
5кой системы.Инкубируют 30 минут при 370Си определяюттитр
5комплемента. Параллельно ставится два контроля - контроль гемо-
5литической сыворотки (с физраствором) и контроль комплемента.
5Определив титр комплемента,высчитываем рабочую дозу, кото-
5рая представляет собой титр комплемента, увеличенный на 20-30%,
5так как комплемент в опыте подавляется антигеном.
56. Определение рабочей дозы антигена:
5Раститровывают антиген в конечном объеме 1мл, затем добавляют
5комплемент, штатив встряхивают и оставляют на 1 час при 370С. К
5смеси приливаютпо1мл гемолитической системы и инкубируют 1
5час.
5Титром считается наименьшая доза,при которой прекращается
5задержка гемолиза,т.е.отсутствует его комплементарное дейс-
5твие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составля-
5ющую примерно 1/2 - 2/3 ее титра во избежание комплементарного
5действия при постановке реакции.
57. Постановка реакции РСК.
5- Раститровывают сыворотку больного,предварительно прогре-
5тую при 520С в течение 20минутдля инактивациисобственной
5системы комплемента.
5- Добавляют рабочую дозу антигена,
5- комплемента и инкубируют 10-30 минут при 370С.
5- Затем вносится гемолитическая система и штатив инкубирует-
5ся еще 30 минут при 370С.
5Задержка гемолиза свидетельствует о наличииантителкис-
5пользуемому антигену всыворотке больного.
5Учет РСК с парными сыворотками. (титром специфических в дан-
5ному антигену антител считается титр последнего разведениясы-
5воротки, полностью тормозящего гемолитическую реакцию.)
5Титром гемолизинасчитается наибольшее разведение гемолизи-
5на, с которым получается полный гемолиз 0,5мл взвесибараньей
5крови в присутствии комплемента.
Реакция Вассермана(РСК) используется для диагностики сифи-
лиса. Антигеном служит экстракт пораженного органа илидругой
аналогичный материал.
II. _2ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
2ЦЕПНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
5- Не серологическая(без использования АГ и АТ),но также
5гибридизации фрагментов ДНК и РНК.0 5высокоспецифическая диагнос-
5тическая реакция.
ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод, теоретически для по-
лучения результата достаточно иметь в среде одну молекулуДНК.
/2400к/
5ПЦР была разработана Мюллесом в 1983г.на основе технологии
Методы ДНК-гибридизации и ЦПР используются длягеносистема-
тики и идентификации патогенных микроорганизмов. /2287к/96/
1Основа метода0 - катализируемое ДНК-полимеразоймногократное
образование копий (амплификация) определенного участка ДНК.
1Этапы метода:
│- термическое разделение 2-нитевой молекулы ДНКна отдель-
│ ные цепочки (30-40с. при 93-955о0С),
│- охлаждение среды и
│- внесение праймеров,комплементарных нуклеотиднымпосле-
│ довательностям обеих цепочек.
Для запуска реакции используют синтетические _1праймеры.0 - оли-
гонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующие
с окончаниямипоследовательностейи образующие последователь-
ности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную
полимеразу (tag-полимеразу/отвида бактерии Thermus aquati-
cus/), что запускает образованиевторичныхкопий цепейДНК,
после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогрева-
ют. Образующиеся отдельные цепочки остужают,вносят праймеры и
снова повторяют процедуру прогрева и охлаждения. /2400к/
После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят ихиденти-
фикацию методом электрофореза. /2400к/
5Для подтверждения принадлежностиДНК возбудителюмолекулы
5можно подвергнутьрестрикции специфическими эндонуклеазами или
5провести реакцию ДНК-гибридизации. /2400к/
5ПЦР позволяютанализировать геномную ДНК или РНК-транскрип-
5ты, выделенные из единственной клетки.И хотяэти методыне
5требуют большогоколичестваклеток, их ограничения связаны с
5доступностью специфических праймеров и их,как правило, приме-
5няли длявыявленияуже известныхилиродственных им генов.
5Такое ограничениебыло преодолено после разработки методов,
5позволивших амплифицировать весь спектр мРНК. В них использова-
5лась природнаяособенность всех мРНК нести поли(А+)-последова-
5тельность на 3'-конце. Комплементарная ДНК (кДНК), полученная с
5мРНК в реакции обратной транскрипции, приобретала таким образом
5сайт связывания одного из праймеровдляамплификации вЦПР.
5Другойсайт былобразованпутем добавления гомополимерного
5хвоста с помощью терминальной трансферазы. Однако все эти мето-
5ды использовали стадию экстракции ДНК, что затрудняло их приме-
5нение в отношении небольшого количества клеток. /2286к/96/0
┌────760 ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ термическая денатурация ДНК (955о0)
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Отжиг праймеров
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴
│ ┬┬┬┬┬┬ - праймер
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Синтез комплементарных нитей ДНК при охлаждении
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ 2┴┴┴┴┴┴0┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ ┴┴ ┬ ┬
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬2┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Завершение первого цикла
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ +
└───── ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
и т.д. ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
5Этот недостаток был преодолен в работе Brady,в которой все
5стадии синтеза кДНК были проведены в одной первичной клеточной
5суспензии без единой экстракции. /2286к/96/
5В последнее время стали пользоватьсябольшойпопулярностью
5магнитные бусыфирмы "Dynal".Последовательности олиго(дТ)25,
5ковалентно сшитые с бусами,позволяют легко выделятьмРНКиз
5общего пула РНК или лизата клеток. /2286к/96/ (...)
5Все стадии синтеза кДНК проводятся на магнитных бусах.Воз-
5можность работы с ДНК,находящейся на магнитных бусах, в соче-
5тании с ПЦР позволяет применять данный подход кмаломуколи-
5честву исходного материала. /2286к/96/
Преимуществом метода является также возможность быстро полу-
чать вторыецепи кДНКнауже синтезированных первых цепях с
олиго(дЦ)-хвостами. Такие матрицы хорошо хранятся в буфере при
45о0С. /2286к/96/