Биотехнология, биопрепараты (вакцины, сывортки, прививки и т.д.)

                 2БИОТЕХНОЛОГИЯ. БИОПРЕПАРАТЫ.

   БИОТЕХНОЛОГИЯ - технология,т.е.  способ получения продуктов

из биологических объектов или с применением биологических объек-

тов. (Спор - это наука или производство.)

   В качестве биологических объектовчаще  всегоиспользуются

клетки (микроорганизмов,растительного или животного происхож-

дения). Преимущества:

   1. клетки  являются своего рода биофабриками белков,жиров,

углеводов, витаминов, нуклеиновых кислот, аминокислот, антибио-

тиков, гормонов, антител, ферментов, спиртов;

   2. клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся (бактерии -за

20-60 мин., дрожжевые - за 1,5-2 часа, животная - 24 часа),

   3. биосинтез сложных веществ,таких как белки, антибиотики,

антигены, антитела и др.значительно экономичнее и технологи-

чески доступнее,чем химический синтез. Для биосинтеза исполь-

зуются отходы сельскохозяйственной,рыбной продукции,пищевой

промышленности.

   4. возможностьпроведения  биотехнологическогопроцессав

промышленных масштабах.

   _Направления биотехнологии.:

   - медицинская (фармацевтическая, иммунная)

   - сельскохозяйственная (ветеринарная, растений)

   - промышленная (пищевая,легкая промышленность, химическая,

энергетическая)

   - экологическая (очистка, деградация).

                     _История биотехнологии

                   (_исторические достижения.)

   - Земледелие, животноводство - 10-11 тыс. лет назад.

   - Селекция (интуитивная,например, пшеницы, домашних живот-

ных), затем научная.

   - Биотехнология возникла примерно 5-6 тысяч лет назад, когда

люди научились выпекать хлеб,варить пиво,приготовлять сыр и

вино.

   - В 19 веке Пастером была открыта природа брожения(начался

научный этап биотехнологии).

   - Открытие  многих микроорганизмов и способов их получения в

большом количестве (сформировалась техническая  микробиология);

в настоящее время из 100000 видов микроорганизмов  используется

не более 100 5(см.ниже)0.С 70-80-х годов ХХ века начали полу-

чать штаммы-суперпродуценты.

   - Искусственное оплодотворение в животноводстве, искусствен-

ное опыление в растеневодстве.Трансплантация эмбрионов (в жи-

вотноводстве).Разработка технологии искусственного оплодотво-

рения человека.

   - Биодобавки в медицине, животноводстве, растеневодстве.

   - Трансплантация органов.Переливание крови. Позднее созда-

ние искусственных органов (искусственная почка ...).

   - Выделение ферментов,использование иммобилизованныхфер-

ментов в молочном деле и пр.

   - Разработка получения МАТ (моноклональных антител) гибридом

(Келлер и Мильштейн, 1975; Нобелевские лауреаты)

   - Разработка  и применение биосенсоров - технических средств

детектирования веществ (с помощью антител,ферментов, рецепто-

ров...). Уже созданы биосенсоры более 100 веществ. /1990г./

   _- Развитие генной инженерии..Технология включения гена (ин-

сулина и пр.) Е.coli.

   -- Использование микроорганизмов (бактерий,дрожжей,виру-

сов)как  реципиентовчужеродного генетического материала для

получение БАВ.Например,получены 2рекомбинантные0 штаммы Е.с.,

продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста; В.subtilis, -

вырабатывающие интерферон, инсулин; дрожжи - продуценты ИЛ, ре-

комбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антиген гепатита

В. Производство лекарственных форм(интерлейкины,интерферон,

тканевый активатор плазминогена, фактор VIII, эритропоэтин, ре-

лаксин,использующийся для расслабленияшейки  матки,гормон

роста,фактор  ростаэпидермиса колониестимулирующие факторы,

МАТ).4В клиниках сегодня (1988г.) проходит испытания около 150

4биотехнологических лекарств.0

   - Разработка  способов переноса генов (впрыскивание в яйцек-

летку, электроток,вирусами, плазмидами). Некоторые методы пе-

реноса дают в результате не трансгенных животных,а 2химер0. Для

этого в эмбрион животного вводятгруппуэмбриональных  клеток

другого вида.Получаемое потомство построено из "мозаики" кле-

ток,часть которых несет гены одного из родителей,а часть  -

другого. 4Так,широкоизвестная сегодня "ковца" (химера козы и

4овцы), выведенная в Кембридже (Англия), является такой химерой.

4От козы она унаследовала рога, а от овцы - лохматую шкуру.0

   - В клетки молочных желез овец введены гены фактораIХССК

(лечение гемофилииВ),другим  - альбумин (используется после

хирургических операций).

   - В 1982г.  Ричарду Палмитеру и Ральфу Бринстеру удалось пе-

ресадитьген  гормонароста крысы мышке.В итоге трансгенная

мышь была в 1,5 раза большего размера, чем обычные.

   - Разработка автоматизированных синтезаторов гена.Получение

рекомбинантных ДНК.Разработка технологии репарации ДНК.С по-

мощью ферментов рестрикции (их обнаружено более 400) разрезается

кольцевая плазмида, вставляется новый участок ДНК.

   - Генноинженерныемикробы (например,"форсбан",защищающий

растения от заморозков),семена и пр.4Рекомбинантные организмы

4попадаютв окружающую среду (известно более 20 случаев).Нега-

4тивные последствия не обнаружены.0

   - Разработан способ усиления естественной способности бакуло-

вирусов поражать насекомых-вредителей, введя в них гены ДНК, ко-

дирующие яды.Если в вирусы встроить гены белков человека, то в

организме хозяина (насекомого) они будут усиленно  продуцировать

данные белки.

   - Клонирование.

   - Технология гибридизации фрагментов ДНК и РНК, на основе ко-

торой разработаны различные методы ( ПЦР =  полимеразнаяцепная

реакция /Мюллис,1983/, лигазная цепная реакция, Q-бета-система и

др.).

   - Созданная  технология получения гомозиготных "knockout"-мы-

шей с отсутствиемвих  генометехили  иныхгенов/Koller

B.H.,1992/.

   _Использование микроорганизмов

   - из  грибов для получения антибиотиков используются актино-

мицеты (род Streptomyces), Penicillium chrysogenum, Clphalospo-

rum acremonium, Streptomyces spp и др.

   - дрожжи (в хлебопечении,пивоварении, виноделии, получении

соков, кормового белка, питательный сред для выращивания бакте-

рий и культур животных клеток);Из 500 известных видов дрожжей

используется только несколько;

   - род Acetobacter для превращения этанола в уксусную кислоту

и уксусной кислоты в газ;

   - род Bacillus - для получения ферментов (В.subtilis)

   -- средства защиты растений (В.thuringiensis);

   - род клостридий - для сбраживания сахаров в ацетон, бутанол;

   - молочно-кислые бактерии(lactobacillus,Leuconostoc,Strep-

tococcus);

   - псевдомонады для получения витамина В4120;

   - коринебактерии glutamicum для получения аминокислот и др.

                         2БИОПРЕПАРАТЫ

   3Классификация

   I. 2Биопрепараты, использующиеся in vivo

   1. АГ-ые (вакцины /вт.ч.  анатоксины/,аллергены,лизаты

микробов для кожных проб), создающие активный иммунитет. Специ-

фические АТ и Тк появляются в кровотоке примерно через неделю у

здорового человека (у лиц с ИД - позже).

   2. АТ-содержащие (антисыворотки,гамма-глобулины,МАТ, им-

мунное молоко),создающие за счет готовых АТ пассивный иммуни-

тет. Однако "примеси" данных биопрепаратов и ксеногенные (лоша-

диные и пр.) АТ запускают активный "вредоносный" иммунитет. По-

этому использование желательно в течение 1 недели послепервой

инъекции (допоявления вторичных АТ и избежания ИК-ых осложне-

ний, васкулитов).Антисыворотки вводят только по жизненным по-

казаниям.

   3. Иммунокорректоры

   - животного происхождения (цитомедины,интерлейкины, интер-

фероны, факторы роста, гормоны /глюкокортикоиды и др./)

   - растительного происхождения (аллергены, лектины)

   - микробного происхождения (БЦЖ, продигиозан, антибиотики)

   - химические иммунокорректоры

   4. Бактериофаги.

   Бактериофаги относятся к эффективным препаратам антимикробно-

го действия,обладающим  строгой специфичностью и не вызывающим

развития дисбактериозов,как это имеет место прииспользовании

антибиотиков.

   II. 2Биопрепараты, использующиеся in vitro

   - Диагностикумы (для РНГА) антигенов микробов (самихклеток,

лизатов, илиочищенных АГ-ов),использующиеся в серологических

реакциях.Иммунодиагностикумы - это часто взвесь известных уби-

тыхмикробов.  Дляинактивации используют высокую температуру,

химические вещества (формалин,спирт,ацетон, фенол), ультраз-

вук,ультрафиолетовыеи  рентгеновские лучи.При выделении из

клеток различных АГ используютметодыразрушения,  экстракции,

обработку ферментами и различными детергентами,  центрифугирова-

ние. /2551к/

   - Антигены,  в т.ч.анатоксины /токсины/ для проведения РП,

РН (для постановки контроля в серологии).

   - Диагностические антисыворотки.Для удаления из антисыворо-

ток группоспецифических антител в сыворотку последовательнодо-

бавляют микроорганизмы,в состав которых входят групповые анти-

гены (метод Кастеллани).Таким образом получают адсорбированные

сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микро-

бов. /2551к/

   - МАТ (мышиные) для ИФА,иммуноблоттинга, ИФМ и пр. сероло-

гических реакций.

                           АЛЛЕРГЕНЫ

   Известно более 200 тысяч аллергенов.

   Аллергией страдает 20% населения земного шара.

   I. ЭНДОАЛЛЕРГЕНЫ

   - тепловые --- тепловая аллергия (на перегрев),

   - ожоговые белки ("аллергия на УФ"),

   - холодовые  эндоаллергены (измененная конформация белков на

холоду) --- холодовая аллергия,

   - появляющиеся новые антигенные детерминанты при физнагрузке

("аллергия на физнагрузку")

   - появляющиесяновые  антигенныедетерминантыпри стрессе

("аллергия на стресс")

   II. ЭКЗОАЛЛЕРГЕНЫ

   31) Растительного происхождения

   Официально зарегистрировано600  (598)видов аллергических

растений.

   1Поллинозы на пыльцу0.Количество пыльцы в воздухе max ранним

вечером и min утром,поэтому период активной деятельности надо

перенести на утренние часы.

   Пыльца деревьев:ива,  ольха,тополь, лещина, береза, дуб,

                     клен, ясень, рябина, вяз, липа, ильм.

   Пыльца хвойных деревьев:сосна,  лиственница,ель,пихта,

                     кедр.

   Пыльца злаков:овес,  рожь, пшеница, пырей, рис, овсянница,

                     ежа, амброзия, тимофеевка, мятлик; загряз-

няющие зерно продукты животного,токсического, химического ха-

рактера (аллергия на пшеничную или овсяную муку).

   Растения, вызывающие фитодерматозы: крапива, середка тополя,

                     волчье лыко,одуванчик, марь, паслен, ле-

                     беда, полынь. /7538/91/

   Аллергены цитрусовых - какие-то белковыекомпонентыкожуры

мандарин, лимонов, апельсин.

   Лук, клубника, малина, земляника, соя ...

   Чай, кофе, шоколад.

   Ваниль, горчица,гвоздика, миндаль, корица, мускатный орех,

чеснок, сельдерей, перец.

   32) Животного происхождения

   - кожный эпителий животных (перья и пух птиц,"шерсть"жи-

вотных --- пуховые и шерстяные изделия)

   - корм для аквариумных рыбок (сухие рачки и дафнии)

   - экстракт тараканов

   - морские продукты, особенно богатые иодом

   - мед,  яйца,рыба и икра,свинина,  куриное мясо,

   - молоко (альфа-лактальбумин, казеин) - 7% аллергий у детей;

У кипяченогомолока аллергические свойства резко падают (меня-

ется структура белков). Молоко заменяют кефиром, творогом и пр.

Сыр.

   - яды насекомых

   - препараты крови, лечебные сыворотки.

   33)1 3микробного происхождения

   - Некоторые АГ пневмококков, стафилококков, стрептококков,

   - АГ дрожжей /аллергия на хлеб/,

   - АГ спор плесневых грибов - ГП (М. более 40 кД),

   - АГ паразитов

   - АГ вакцин

   - Антибиотики

   34) химического происхождения

   - краски,  лаки, моющие средства, косметика (только 20% кос-

метических средств безопасны в отношении аллергии /1652к/),

   - лекарственные препараты (сульфаниламиды,новокаин, дикаин

и др. анальгетики, анестетики /аспирин, анальгин/), [анальгети-

ки - блокируют болевую чувствительность; анестетики - подавляют

любой вид чувствительности]

   - отходы химического производства/профессиональныеболез-

ни/,

   - рентгеноконтрастные вещества

   - дезинфецирующие средства и пр.

[5) физического происхождения (см. эндоаллергены).]

6) Промышленная, бытовая и библиотечная 3пыль0.

   - клещ домашней пыли

   Проба на аллергены: за рубежом накладывают манжету на предп-

лечье с40 ячейками,  в каждой их которых один из основных ал-

лергенов. Через 1-2 сут оценивается зона  покрасненияисоот-

ветствующая ячейка. (У пожилых лиц пробы чаще отрицательные.)

.

               3АНТИТЕЛО-СОДЕРЖАЩИЕ БИОПРЕПАРАТЫ

                 (вызывают пассивный иммунитет)

   АТ-содержащие биопрепараты включают антимикробные илианти-

токсические АТ и используются для лечения или диагностики.  Ан-

тисыворотки используют по жизненным показаниям с целью экстрен-

ной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания).

   1) Кровь, плазма (переливание). Сыворотки. _Антисыворотки..

   2) _Гамма-глобулины. (общие,направленного действия, получае-

мые либо после иммунизации,либо от лица,недавно перенесшего

заболевание).

   3) _МАТ. (пока только мышиные, человеческие гибридомы в насто-

ящее время отсутствуют).

   14) Иммунное молоко. Сочетание парентеральной и диалетической

1иммунизации позволило получить _иммунное молоко.,содержащее ан-

1титела к вибрионам холеры и токсину,ЭПКП,протеям,  шигеллам

1Зонне.В настоящее время наметились 2 тенденциив  технологии

1изготовления препаратов иммунного молока - получение _лактосыво-

_1роток или лактоглобулинов.. Лактосыворотка, в отличие от лактог-

1лобулина,обладает большей буферной емкостью, содержит ингиби-

1торы трипсина и химотрипсина, что в известной степени обеспечи-

1ваетустойчивость белков коровьего молока к действию ферментов

1ЖКТ.Кроме того, некоторые белки лактосыворотки (лактоперокси-

1даза, лактоферрин, лизоцим и др.) оказывают неспецифическое ан-

1тимикробное действие и способыпотенцироватьзащитный  эффект

1специфических антител. /2114к/87/ - (ПОВТОР материала по ОКИ)

   _Получение антисыворотки из молока

   4Молозиво центрифугируютпри 20000 об./мин.2 часа при 4504С,

4липидный слой отделяют (обезжиривание).Казеин осаждают титро-

4ванием 1Н уксусной кислотой до рН 4,6 с последующим центрифуги-

4рованием в тех же условиях.Используют надосадок, который диа-

4лизируют в 0,01М растворе фосфатного буфера с рН 7,0. Для выде-

4ления очищенной фракции Ig Aможноиспользовать  ионообменную

4хроматографию (ИОХ) на ДЭАЭ-целлюлозе. /6737/0

   5) Антиидиотипические АТ используютдля  запускаактивного

иммунитета, поэтому называют антиидиотипическими вакцинами 4(см.

4материал по вакцинам)0

   _2Получение 0 АТ.-содержащих препаратов

   I. От иммунизированных животных

II. Из крови иммунных лиц (недавно выздоровевших)

                     _Иммунизация животных

         ┌────────────────────┴─────────────────────┐

    селезенка мыши                                Кровь

         │                                          │

    выделение                               Ретракция сгустка

    ПК, синтезирующих                       (40 минут,375о0С)

    искомые АТ                                      │

         │                                       Сыворотка

    ПК+ (В-лимфоцит,                         (=антисыворотка)

    инфицированный ВЭБ                              │

    --- лимфомная клетка)                    (Высаливание,

    + ПЭГспиртовое осаждение,

         │                                     адсорбция)

    Гибридома --- активация                         │

         │        клеток                     Гамма-фракция

        МАТ          │                       иммуноглобулинов

                 ИФ, ФНО, ИЛ                        │

                 в питательной               Аффинная хромато-

                 среде                       графия (сорбция

                     │                       на комплекс "АГ-

                     │                       носитель"

                 Реакция на                         │

                 "примеси"                   Моновалентные АТ

   31. Иммунизация

   Первая иммунизация вызывает первичный ИО; вторая и последую-

щие --- вторичный ИО.Многократную иммунизацию называютгипе-

риммунизацией (--- гипериммунная сыворотка).

   Способы иммунизации животных:

   2- в/кож.0 (объем до 100 мкл) --- региональные ЛУ

   2- п/кож.0(объем 1-30 мкл).При данном способеиммунизации

антиген распространяется медленно,т.к. подкожная клетчатка не

имеет развитых лимфатических протоков.

   2- в/мыш.0(0,5-8мл  соответственно для мышей-кроликов) в об-

ласть бедра; птицам в грудную мышцу.

   2- в/бр.0 (2-30мл соответственно для мышей-кроликов); при этом

животное опускается головой вниз;

   2- в/в0 (1-10мл);если в боковую вену хвоста, то хвост предва-

рительно опускается в стакан с горячей водой -555о0С;

   2- интраназально0(по  каплямот 0,03 до 1 мл соответственно

для мышей-кроликов);

   2- оральное введение0 (0,3-5 мл): антиген смешивают с кормом и

скармливают или в виде питья,можно через зонд --- вжелудок.

/7143/89/1

   - 2per rectum0

   5Пример:

   5Один объем антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта

5Фрейнда и тщательноперемешивают.Полученную  эмульсиювводят

5внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины, расположенных по 5 в ряд

5на расстоянии 2 см по обе стороны от позвоночника.  Общаядоза

5иммуногена равна 10-100 мкг на кролика. Иммунизируют 6 кроликов

5массой по 2 кг.Через 8-10 недель проводят пробное кровопуска-

5ние.При  удовлетворительном качестве антисыворотки последова-

5тельно проводят до 3 кровопусканий,после чегокроликамдают

5отдохнуть в течение 1 месяца и затем делают следующие кровопус-

5кания. При неудовлетворительном качестве антисыворотки проводят

5вторичнуюиммунизацию,  используя половинную дозу иммуногена в

5неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизируют подкожно в складку ко-

5жи на шее.Через 10 суток делают пробное кровопускание и опре-

5деляют качество антисыворотки. При неудовлетворительном качест-

5веиндивидуальной антисыворотки иммунизируют новую группу кро-

5ликов или животных другого вида. /6817/84/0

   32. Получение крови и сыворотки

   У животных или иммунизированного человека берут кровь в пус-

тыепробирки,  после ее свертывания откручивают на центрифуге,

получается т.н.антисыворотка,из которой можно выделить гам-

ма-глобулиновую фракцию.

   Противоэнцефалитный иммуноглобулин получали из сывороток лю-

дей, проживающих в местах распространения данного  заболевания,

содержащих достаточновысокий уровень специфических противови-

русных антител. /1430к/

   32. 2О3чистка0 (3фракционирование0) и тестирование

   - Осаждение

     -- высаливанием(осаждение сульфатом натрия или сульфатом

        аммония)

     -- осаждение спиртом

     -- полиэтиленгликолем (ПЭГ)

     -- каприловой кислотой

   - ферментирование

   - диализ

   - адсорбция

     -- аффинной хроматографией

     -- выделение на белок А-сефарозе (FcR золотистого стафило-

        кокка)

   Силу антитоксических сывороток измеряют в международных еди-

ницах (МЕ) по способности нейтрализовать определенную дозу ток-

сина.

                         _Антисыворотки

   - Лечебные         │(используется только по

   - Профилактические │жизненным показаниям)

   - Диагностические

   По специфичности различают

- моновалентную антисыворотку

- поливалентную антисыворотку

- антицельную антисыворотку (против всех сывороточных белков  -

36)

   _Недостатки антисывороток.:

   - Выделенная из крови сыворотка,сколько бы ее не очищали и

ни концентрировали,содержит набор различных антител.Поэтому

ее называют поликлональной.Лишь _небольшая часть антител.нап-

равлена _против специфичных антигенных детерминант..

   - Иммуноглобулины антисывороток уже с открытымиуглеводными

компонентами, поэтому _быстрее выводятся из организма..

   - Углеводные компоненты,переплетаясь между собой, приводят

к спонтанной _агрегации белков. при длительном хранении, что спо-

собствует в кровотоке закупорке некоторого количества  капилля-

ров и активации системы комплемента по альтернативному пути.

   - "_Примесные АТ." дают многочисленные "перекрестные"  положи-

тельные реакции,которые приводят к ошибочным диагнозам по се-

родиагностике.

   - "_Примесные АГ.". Иные белки сыворотки могут содержать раст-

воримые (сброшенные) антигены HLA,АВ, Rh, иные аллотипы анти-

тел и др., что иммунизирует реципиента.

   - Ксеногенные (лошадиные) сыворотки при повторном введении в

организм могут вызывать _аллергические реакции. на чужеродный бе-

лок.Поэтому необходима постановка _внутрикожной пробы. ссыво-

роткой в разведении 1:100 в объеме 0,1 мл.  Введение антитокси-

ческой лошадиной сыворотки допустимо лишь вслучаеотсутствия

выраженной кожной реакции в течение 20-30 минут. /1430к/

- Еще один серьезный недостаток:для получения антител каж-

дый раз необходимо _заново иммунизировать. животных и очищать вы-

деленную сыворотку. Это стоит немалых денег.

_Гамма-глобулины (преимущественно Ig G)

   Содержание антител в препаратах иммуноглобулинов человека:

   - АТ к токсинам (дифтерийному, столбнячному, пертуссигену)

   - Титры агглютинирующих АТ к штаммам возбудителей располага-

ются в следующем порядке (по убыванию)

   -- P. aeruqinosa

   -- S. sanguis,

-- B. melaninogenicus,

   -- B. bronchisrptica,

   -- Veillonella,

   -- E. coli.

   Титры к E.c. очень низкие. /2384к/84/

                Использованиеиммуноглобулинов

              для пассивной иммунизации /7330/87/

────────────────────┬─────────────────────┬────────────────────

   Пулированные     │    Специфические    │    Специфические

   Ig человека      │     Ig человека     │    лошадиныеIg

────────────────────┴─────────────────────┴────────────────────

Гуморальный ИД       Гепатит В              Ботулинум токсин

Гепатит АБешенство              Дифтерийный токсин

Корь                 Столбняк               Змеиный яд

                     Ветряная оспа          Яд паука

                     Натуральная оспа       Black widow

                     (коровья оспа)

                     Rh изоиммунизация

                     pertussis

───────────────────────────────────────────────────────────────

                              2МАТ

   2МАТ (моноклональныеантитела)0-  АТ,полученные из одного

клона культуры плазматических клеток.

   МАТ с запрограммированнойспецифичностьювпервые  получили

аргентинецЦ.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер (G.Koh-

ler) /Nature. - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что в 1978 году

им была присвоена Нобелевскую премию.Они рассчитывали исполь-

зовать гибридомы лишь для изучения генетики антител,а резуль-

тат привел к подлинному буму.

   К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, нес-

колько тысяч гибридом, в т.ч. на 600 вирусных антигенов.

   _Получение

   1а) В-лимфоциты + вирус Эпстайна-Барра --- клеткибыстропе-

1рестаютсинтезировать  АТ--- формируются опухолемые лимфомные

1клетки

   1б) В-лимфоциты селезенки иммунизированной АГ-ом мыши +мие-

1ломная лимфоцитарная клетка + ПЭГ (полиэтиленгликоль) --- слия-

1ние клеток (одной на миллион) --- далее размножается лишь гибрид

1- гибридома (неограниченное размножение).

   В основу метода положен давно известный принцип гибридизации

(слияния) соматических (неполовых) клеток с последующим выделе-

нием и культивированием необходимого гибридного клона. Для сли-

яния используют клетки двух видов.Первые - плазмоцитомы (опу-

холевые плазмоциты) из линий,  культивируемыхвискусственных

условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интен-

сивно размножаются без всякого внешнего стимула.  Другие клетки

-иммунные лимфоциты.Они несут в себе способность синтезиро-

вать и выделять необходимые антитела.Однаков  пробиркеэти

клетки существуют лишь несколько дней.

   Образовавшийся прислиянии  двухклетокгибрид  наследует

признаки обоих "родителей".

   3Получение гибридом включает 6 основных этапов.

   1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам анти-

гена, против которого необходимо получать антитела.

   2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с егоже

опухолевыми клетками.Длясоединения клеток используют обычно

полиэтиленгликоль, разрушающийповерхностныемембраны  и спо-

собствующий соединению клеток.

   3. Отбор гибридов.Клетки культивируют в среде,содержащей

гипоксантин. Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его

разрушающего, а лимфоциты - просто потому,что не умеютдолго

поддерживать свое существование вне организма.

   4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вы-

рабатывают3 0антитела против антигена, использованнного для имму-

низации. Антиген прикрепляют к какому-либо носителю,  например,

к пластиковым шарикам или пленке.Такой иммобилизованный анти-

ген обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гиб-

ридомы,а затем наносят меченые антителапротив  мышиныхили

крысиных гибридомных антител (их метят радиоактивными, флуорес-

центными или ферментными метками). Иными3 0словами, проводят ана-

лизкультуральной  жидкостина присутствие антител к искомому

антигену.Если гибридомы производят антитела, то они осядут на

антигене,а к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антите-

ла. В результате метка соединится с антигеном на носителе и за-

фиксируется.

   5. Клонирование.Для  этойцели несколько гибридных клеток

переносят на питательную среду таким образом,чтобы ониросли

на достаточномрасстоянии друг от друга.Через несколько дней

вокруг каждой образуется колония дочерних клеток.  Этоиесть

гибридома. Клеткиколонииснова  разводят и помещают на пита-

тельную среду,чтобы устроить новые колонии. Клонирование пов-

торяют 3-4 раза,после чего получается устойчивая и продуктив-

ная линия клеток.

   6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональ-

ных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в

искусственных условиях или непосредственно из животных,  приви-

тых гибридомными клетками (как и многие злокачественные  опухо-

ли, гибридому можно прививать).

   _Недостатки МАТ:

   1. Одна из проблем,связана с тем, что МАТ - продукты _мыши-

_ных. гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получе-

ния человеческих МАТ.

   2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантойиотсутс-

твие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной мо-

лекуле антигена. (_Неполные АТ. не образуют ПИК, нельзя использо-

вать в РА /только Кумбса/, РП)

   43. Возможностьнепредсказуемых перекрестных реакций с поли-

4функциональными антигенными детерминантами.Вследствие этого -

4низкий аффинитет МАТ.0

   _Преимущества МАТ:

   1. Главная  особенность МАТ - _чрезвычайная моноспецифичность

(против одной антигенной детерминанты)и абсолютная  однород-

ность. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значе-

ний, предельных для живой природы. Отсюда возможность использо-

вания для анализа антигенов не высокой степени чистоты.

   2. Возможность многократного получения в течение длительного

времени (воспроизводимость). _Неограниченное количество. получае-

мых антител.

   3. МАТ  предполагаетсяиспользовать_в лечебных целях. в ка-

честве целенаправленных носителей, в состав которых будут вклю-

чены токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные

препараты.Такие конъюгаты можно использоватьв  химиотерапии

опухолейипри трансплантации органов и тканей (введением МАТ

против CD 4,8;через 13 суток вырабатывались АТна  введенные

МАТ). /6815,6816/

   _Достижения

   - наборы для диагностики СПИДа, гепатита, инфаркта и пр.;

   - производство "центоксина" - МАТ,связывающих яды при сеп-

сисе;

   - производство антиидиотипических антител, "аналогичных" ин-

сулину (регуляция рецепторного апппарата, замена инсулина);

   - использование МАТ к интерлейкинам и другим цитомединам для

иммунокоррекции.

                              2МАТ

              Основные дифференцирвочные антигены

             (Номенклатура антигенов СВ от 1993г.)

                /7070,94;7273/94,6504/90,7293/

───────────────────────────────────────────────────────────────

АГ,МАТ     │   Распределение   │           Функции

───────────────────────────────────────────────────────────────

CD1a,1b,1c   Тимоциты, клетки   Гомологичны HLA I класса

gp49,45,43   Лангерганса (=ДК),(3 варианта 7a0-цепи)

=7a0-цепь    часть В-лимфоцитовМаркер ранней фазы созревания.

   7b0-цепь                        7b02-микроглобулин

_CD2.gp50    Т-клетки, ЕКК,      _Рецептордля ЭБ (эритоцитов барана)

с/с Ig      тимоциты,           Т-лимфоцитов (LFA-2)

             большинство         Принимает участие в неспецифической

             тромбоцитов,        активации ранних тимоцитов(до

             на моноцитах /?/    появления  антигенных рецепторов).

_CD3.20кД    Т-клеткиЧасть рецепторного комплекса для

с/с Ig-?    зрелые              антигенов.

                                 _(СD3+,CD56-) - маркер Т-лимфоцитов

_CD4. 59 кД    _Т-хелперы.,          Взаимодействие с HLA II класса,

с/с Ig      моноциты,           ВИЧ-рецептор

             (2/3 периферических (Гены относятся к суперсемейству

             Т-лимфоцитов)       генов иммуноглобулинов)

CD5gp67    Т-,часть В-клеток                ?

CD6gp100   - " -,тимоциты                   ?

_CD7.gp40    Т-клетки,тимоциты   Рецептор для иммуноглобулина М

Первый антиген протимоцитов

(Критерий диагностики острых

                                 Т-клеточных лейкозов)

_CD8. 32/22    _Т-киллеры.,          Взаимодействие с HLA I класса

с/с Ig      _Т-супрессоры.        (рецептор HLA I)

             (на 1/3 перифери-   Гены внеклеточных 2 доменов

             ческих лимфоцитов)гомологичны  генам дометов Ig.

CD9 gp 24    Моноциты,пре-В-клетки?

             тромбоциты

CD10100    Пре-В-клетки,грану- Нейтральная эндопептидаза.

             лоциты, лимфоидныеАнтиген, выявляемый при острой

             предшественники     лимфоцитарной лейкемии

CD11а 180    Лейкоциты           7a0-цепь LFA-1 (молекулы адгезии)

CD11b 155    ЕКК,миелоидные      CR3-рецептор (для С3bi), Мо-1,

             клетки, Т-subset7    a0М-цепь интегрина СD 11b/18,

           моноциты,гранулоциты ICAM-1

CD11с 150       - " - ,          СR4,7a0Х-цепь интегрина СD 11с/18

             часть В-лимфоцитов

СD13150    Моноциты,гранулоциты Аминопептидаза N

В присутствииМАТ к АГ проис-

ходит активация клеток

CD14           - " -             Мо-2

CD16 50-65   Гранулоциты, ЕКК,   Fc7п0R типа 3 (с низкой аффинностью)

             Т-subset,макрофаги

СВw17        Гранулоциты, моно-Лактозилцкрамид

             циты, тробоциты

CD18   95    Лейкоциты           7b0-субъединица (цепь) интегринов

CD11а,b,с/CD18 = ICAM

_CD19.   95    _В-лимфоциты.         sIg M-ассоциированная молекула

                                 _(маркер В-лимфоцитов).1

_CD20.   35    _В-лимфоциты.         Антитела к CD20 вызывают пролифе-

рацию клеток.

_CD21.140       -"-              СR2 (рецептор для С3d),рецептор

                                 для  вируса   Эпштейна-Барра

CD237ф045    Активированные      _Fc7e0R. II (низкоаффинный рецептор)

             В-клетки

CD237и045    В-клетки,моноциты,               -

             эозинофилы,Т-subset

СD24 41/38   В-клетки,          Костимуляция  Т-хелперов-?

             гранулоциты

_CD25 .55    Активированные Т- и Низко-аффинный_ IL-2-рецептор

             В-клетки,макрофаги(7b0-цепь)

CD29120    Многие типы клеток  7b0-1-цепь интегринов, GPIIa

СВ31140    Тромбоциты,моноциты, GPIIa

             гранулоциты,В-лимфо-

             циты, (Т-лимфоциты)

_CD34. 105-120 Ранние предшествен- Рецептор L-селектина (СD62L).

             ники гемопоэза      _Маркер миелоидных и лимфоцитар.-

                                 _ных лейкозов.

CD35220    Гранулоциты,моноци- CR1 (рецептор для С3в)

             ты,эритроциты,ДК,

             ТК,В-лимфоциты

CD41 120/133 Клетки тромбоцитар- GPIIb/IIIa,GPIIb

             ного ряда

CD44 200/220 Лейкоциты,          Pgp-1,рецептор гиалуроновой

    /180/190 эритроциты          кислоты, HCAM

   gp 80-95  головноймозг      Рецептор хоминга /7293/

_CD45. 180-220 Лейкоциты           Общий лейкоцитарный антиген

(Семейство родственных ГП на

лейкоцитах)

Клетки CD4+/СD45+ идентифици-

рованы как _индукторы супрессоров

CD49a 210    Тромбоциты          VLA-1, (7a01-цепь интегринов)

CD49b 160  Тромбоциты          VLA-2, (7a02-цепь интегринов),GPIa

CD49c 125    Тромбоциты          VLA-3, (7a03-цепь интегринов)

CD49d 150/   Моноциты,Т-лимфо-   VLA-4, (7a04-цепь интегринов),

      80/70  циты, тимоциты,     рецептор для фибронектина,

           В-лимфоциты,        рецептор VCAM (CD 106)

             клетки Лангерганса

_CD49е. 135/   Тромбоциты          VLA-5, (7a05-цепь интегринов),

      125                        рецептор фибронектина

CD49f 120/25 Тромбоциты          VLA-6, (7a06-цепь интегринов),

             Т-лимфоциты         рецептор ламинина, GPIc

CD50121    Лейкоциты           ICAM-3

CD51/61      Тромбоциты          Рецептор витронектина,7 b03-цепь

     21-28                       интегринов, GPIIIa

CD5490     Многие типы клетокICAM-1

CD55           - " -             ФУР (DAF) - фактор, ускоряющий

расщепление С3- и С5-конвертаз

комплемента

_CD 56 ........                   Маркер ЕКК (СD56+ CD3-)

CD58 40-65   LFA-3               Лейкоциты, лиганд CD2

CD62E 115    Эндотелиальные      Е-селектин,ELAM-1, рецептор

             клетки              CD15s

CD62L 75-80Предшественники     L-селектин, LAM-1, LECAM-1

             гемопоэза,лимфоциты,

             моноциты,гранулоциты

CD62P 150    Активированные      Р-селектин, PADGEM

             тромбоциты, эндоте-

             лиальные клетки

СD64   75    МоноцитыРецептор Fc7g0 IgG типа I (Fc7g0RI)

CD71         Пролиферирующие     Рецептор трансферрина

gp90-95    клетки, моноциты,

gp43/39    эритроидные пред-

   p69       шественники

СВ73p69    Т- и В-клетки       Экзо-5'-нуклеотидаза

CD74         В-лимфоциты,        HLA II-ассоциированная инвариантная

gp41/35/33  моноцитыцепь, LN2

CDw75-     Зрелые В-лимфоциты, 7a0-2,6-сиалилтрансфраза, LN1

CD10260    Многие типы клетокICAM-2, рецептор CD 11a/18

CD106        Эндотелиальные      VCAM-1, рецептор CD 49d/29

    100/110  клетки

CD107a 110   Тромбоциты          LAMP-1

CD107b 120      - " -LAMP-2

СDw116 75-85 Миелоидные пред-    Рецептор ГМ-КСФ

             шественники,моноци-

             ты, макрофаги

_CDw119 . 90   ЕКК,Т-, В-лимфоциты Рецептор7 п0-интерферона

_CD120а . 55   Т- и В-лимфоциты    Рецептор для ФНО-55 кД

_СD120b . 75   Т- и В-лимфоциты    Рецептор для ФНО-75 кД

_CDw121a. 80   Т-лимфоциты         Рецептор для IL-1 типа 1

(IL-1R1)

CDw121b 68   Т-лимфоциты,грану-Рецептор для IL-1 типа 2

             лоциты,предшест-    (IL-1R2)

             венники гемопоэза

_СD122 .75   Активированные      Рецептор IL-2-75кД (IL-2Rb)

             лимфоциты,моноциты,

             часть покоящихся

             Т-лимфоцитов

CDw124 140   Лимфоциты,моноциты, Рецептор IL-4 (IL-4R)

             предшественники

             гемопоэза

СD126   80   Т-лимфоциты,активи- Рецептор IL-6 (IL-6R)

             рованные В-лимфоциты,

             моноциты,тромбоциты,

             гранулоциты

CDw12775   Т- и В-лимфоциты,   Рецептор IL-7 (IL-7R)

             макрофаги

CDw128 58/67 Гранулоциты         Рецептор IL-8 (IL-8R)

CDw130 130                       Рецептор IL-6 (IL-6R)

gp1300 sig

───────────────────────────────────────────────────────────────

   Примание: LFA - лимфоцитарный функцио-ассоциированный АГ

              ДК - дендритные клетки

             КСФ - колониестимулирующий фактор

             ФНО - фактор некроза опухолей

          c/с Ig - cуперсемейство иммуноглобулинов

              2ИММУНОПРОФИЛАКТИКА И ИММУНОТЕРАПИЯ

   Иммунопрофилактику и иммунотерапию инфекционныхзаболеваний

проводят с помощью

   - вакцин,  в т.ч.анатоксинов (препаратов индукции активного

противоинфекционного иммунитета за счетмобилизациимеханизмов

иммунологической памяти);

   - иммунных сывороток и иммуноглобулинов - препаратов, содер-

жащих готовые специфические антитела,введение которых в орга-

низм приводитк немедленному приобретению пассивного гумораль-

ного иммунитета, /1430к/

   - иммунокорригирующих средств (интерлейкинов,факторов рос-

та, интерферонов, цитокинов).

                          2Анатоксины

   Анатоксины - препараты,содержащие инактивированный токсин,

вырабатываемый микробом. (Токсины - экзо- и эндо /ЛПС Г-/). Эти

препараты обеспечивают выработку иммунитета к токсину соответс-

твующего возбудителя.Используются вместе с адъювантом.

   _Примеры

   - Дифтерийный (АД)

   - Столбнячный (АС)

   - Сексанатоксин,тетраанатоксин (токсины возбудителей газо-

вой гангрены)

   - Стафилококковый

   - Комбинированные препараты

     -- дифтерийно-столбнячный (АДС)

     -- коклюшно-дифтерийно-столбнячный (АКДС)

   _Приготовление. (выделение + адъювант)

   - Токсины получают путем фильтрования жидкой питательной сре-

ды или исследуемого материала. где размножались токсигенные бак-

терии. Анатоксныполучаютпутем  обработки токсинов формалином

(0,3%раствор /0,4%/) при температуре 375о0 /395о0/  втечение30

дней.При этом токсин теряет токсические свойства, но сохраняет

антигенные.

   - 4Эндотоксины Е.coli (О111:В4) выделяли 3 методами

(4безводным фенолом0,4охлажденным бутанолом0,4и их смесью.0 4Гель-

4фильтрация.0)4 /7661/79/

   3Адъюванты0 (adjuvans помогающий,поддерживающих) - компонент

иммунизируемого препарата, необходимый

1) для более длительного сохранения в организме в месте введе-

   ния;

2) для повышения иммуногенности,допустим,гаптена (полиионы)

3) Адъювантможет  быть с иммуностимулятором (БЦЖ,  тималином,

   ГМ-КСФ /2648к/,HLA4II 0/при иммунизации комплексом АГ сHLA

   II класса антигенность значительно повышается/ и др.); тогда

   он называется полным. Например, адъювант Фрейнда (неполный =

   минеральное масло + эмульгатор; полный = минеральное масло +

   БЦЖ).

   1Виды адъювантов

   1. _Минеральные сорбенты и масла

- Al(OH)430 - гидрооксид (гидрат окиси) алюминия,который полиме--

ризует АГ.  Следует учитывать,что алюминий вызывает слабобу-

мие.

- фосфат алюминия

- алюминиево-калиевые квасцы

- масляные адъюванты (оказывают побочноедействие) /2112к/

Адсорбированные препараты,   т.е.  осажденныенаколлоидных

субстратах (гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия),содной

стороны, с повышенной иммунологической эффективностью благодаря

созданию в организме "депо" в месте инъекции, а с другой сторо-

ны, сусиленной  иммунологическая реактивность организма (адъ-

ювантное действие сорбента.(Л 4Т.А.0)

   2. Микробного происхождения.

   - Целые  _бактериальные клетки.

     -- вакцина БЦЖ,

     -- Bordetella pertussis,

     -- Сor.parvum-?х

   - извлеченные из микробов химические вещества

     -- ЛПС, липид А ЛПС-да илиэндотоксин  E.coli/7958/,

     -- ГП  /1338к-с.253/,

     -- Пептидоглюкан клебсиелл. /2295к/

     -- Холерныйтоксин в микродозах (в мукозальных вакцинах).

        Используют субъединицу Вмолекулы  холерноготоксина,

        обеспечивающегорецепцию холерного токсина на клетках.

        Токсин обладает иммуномодулирующей активностью: активи-

        руются  Тх2в слизистой кишечника,усиливается синтез

        sIg A и Ig E./2295к/ Холерный токсиниспользуется  в

        качественосителя для доставки различных антигенов (он

        очень устойчив к действию ферментов слизистых оболочек,

        а также к лимфоцитам). /2631к/99/

   3. _Полиионы.(полинуклеотиды,полианионы) или смесь тих ве-

ществ. /7143/89/ Это неприродные полиэлектролиты с М.от 10 до

100 кД.Полиионы  стимулируют иммунный ответ в 30 и более раз.

/2380к/ Полиэлектролиты (замещают функцию Тх-ов):  комплекс АГ+

полиэлектролит превращает АГ в Т-независимый. ─── Новое поколе-

ние вакцин (против чумы и брюшного тифа). /2318к/

- Полиакриловая   кислота   (ПАК)

- Сополимер4-винилпиридинаи  4-винил-N-этилпиридинийбромида

(МЕ-3);

- сополимер акридиловой кислоты и N-винилпирролидона (NА-5),

- полиамин. /2318к/

   4. Использовании _липосом. в качествеадъювантане получило

практического применения. /2295к/

   Липосомы - фосфолипидные микроскопические пузырьки. Липосомы

способны адсорбироватьсянаклетках и их содержимое поступает

внутрь клетки.Липосомы могут захватываться фагоцитами. Гидро-

фобные АГможно вводить в состав фосфолипидов,гидрофильные -

как внутреннее содержимое липосом. В экспериментах "липосомные"

вакцины вызывали   тысячекратное   усиление  иммунногоответа.

/1430к/

   5. _Другие. соединения.

- декстран (стрептококков,вейлонелл ротовой полости) стимули-

рует гуморальный иммунитет;

- метилцеллюлоза

- ПАВ (поверхностно-активные вещества)

4-- бромид диметилдиоктадециламмония (ГЗТ,ингибирует компле-

     4мент)

4-- многоатомные спирты (L101,L121) --- инактивируют компле-

     4мент) /2403к/

- тапиока

- мурамилдипептиды

- sodium alginate /7330/87/

                            3ВАКЦИНЫ

      - АГ-содержащие препараты микробов или их продуктов

       (направлены на формирование активного иммунитета)

   В последней  трети ХХ века получила всеобщее признание точка

зрения, согласно которой вакцинация является одним  изметодов

борьбы за активное долголетие как в развивающихся, так и в эко-

номически развитых странах. Целенаправленная вакцинация, прово-

димая в мире в течение многих лет, обеспечила существенное сни-

жение заболеваемости корью,  полиомиелитом,столбняком, коклю-

шем. /2318к/97/

   _Вакцины применяются

   1) для профилактики заболеваний

     -- плановаявакцинация детского населения

     -- вакцинацияопределенного  контингентавопределенных

        районах /например,вакцины против зооантропонозных ин-

        фекций, клещевого энцефалита/),

     -- вакцинация в определенное время (по эпидемическим пока-

        заниям (гриппозная вакцина),

5При гриппе,как и при любой другой инфекции,можно эффективно

5воздействовать на эпидемический процесс только после того,  как

5адекватнойиммунизацией  будет охвачено не менее 80-90%  всего

5населения. Однако это условие еще никогда не было выполнено.0

   2) для  леченияхронических заболеваний или течений (напри-

мер, поражениях аденовирусами,вирусом герпеса)./2295к/  Это

направление значительно более ограничено.С этой целью исполь-

зуют чаще убитые вакцины (стафилококковую,гонококковую).

   В России также накоплен большой положительный опыт борьбыс

распространенными инфекционными заболеваниями. Однако в послед-

нее время существенно _снижаются объемы и  эффективностьвакци-

_нопрофилактики., проводимой в нашей стране.Это обусловлено ря-

дом обстоятельств:

   - снижается процент лиц, подвергающихся вакцинопрофилактике,

что связано с увеличением частотыслучаевпротивопоказанийк

вакцинации (ИД, аллергические заболевания),

   - применяемые в настоящее время вакцинирующие средства отно-

сятся кпрепаратам старого поколения и не обеспечивают стойкий

иммунитет у лиц, прошедших вакцинацию. /2318к/97/

   - Применение вакцин малоэффективно на фоне ИД-ых состояний.

/2318к/97/

   - Политико-экономическая ситуация в России.

   3История

   Название "вакцины"было  даноЛ.Пастеромвсем прививочным

препаратам, полученным из микробов и их продуктов (от лат. vac-

ca -корова).  Э.Дженнеромбыла получена первая живая вакцина,

содержащая вирус коровьей оспы,идентичный по антигенным свойс-

твамвирусу  натуральной оспы человека,но маловирулентный для

человека.Это был первый природныхвакцинный  штамм.Л.Пастер

разработалпринципы направленного получения вакцинных штаммов -

селекцию мутантов с пониженной вирулентностью 4путем  культивиро-

4вания их в определенных условиях или пассирования через организм

4устойчивых к данной инфекции животных.0 /1430к/

   3Получение вакцин

   Из стратегий  разработки инактивированных вакцин заслуживают

внимания следующие./2631к/99 и др./

   1) Получение микробов методом селекции, пассирования. (Выра-

щивание микробов, очистка.)

   - Использование целых микробов

     4Вирусные вакцины на

     4- курином эмбрионе

     4- фибробластах

     4- культуре клеток опухоли

     4- культуре клеток почек.

   - Использование инактивированных микробов (как правило,хи-

мическими веществами). /2631к/99/

   - Выявление  из дивергентных линий возбудителя,  возникших в

естественных условиях (например, вирус коровьей оспы для приви-

вок против натуральной оспы). (Л 4Т.А.0)

   2) Получение in vitro псевдочастиц,не способных к реплика-

ции. /2631к/99/

   3) Создание вакцин на основесекретируемых  антигенов,кап-

сульных полисахаридов,полисахаридов, конъюгированных с белка-

ми, а также субъединиц микробов и белковых оболочек. /2631к/99/

   - Получение рибосомальной фракции микробов --- рибосомальные

     вакцины.

   4) Применение   антигенов,  синтезированныхрекомбинантными

микробами и синтезированных антигенов с В- и Т-эпитопами./2631к/

   4- Генно-инженерные вакцины.

   - 4СамосборкаVP2-белка  парвовируса свиней (псевдочастицы).

4Данные псевдочастицы используютсядлядоставки  вцитоплазму

4клеток эпитопы,чужеродные цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ).

4Этосвойство  хотят   использовать   для   получения   вакцин.

4/2632к/99/0

   4-

   5) Получение ДНК-вакцин. /2631к/99/

   6) Применениев качестве АГ химически и генетически инакти-

вированных токсинов (_анатоксинов.). /2631к/99/

   7) Использование в качестве антигенов антиидиотипических ан-

тител. /2631к/99/

   _Общие требования к вакцинам

   1. Высокая иммуногенность(либо  иммуностимулирующее,либо

десенсибилизирующее действие).В идеале иммунитет, создаваемый

вакцинами,должен приближатьсяк  иммунитету,формирующемуся

после инфекционного процесса, поскольку последний является наи-

более напряженным и полноценным. /2299к/90/

   2. Ареактивность (отсутствие выраженных побочных реакций).

   3. Безвредность иминимальное  сенсибилизирующеедействие.

/1430к/

   До настоящеговремени далеко не все вакцинные препараты от-

вечают этим требованиям. /1430к/

   3Введение вакцин0 (иммунизация)

   - подкожно (вакцины против кори,АДС-анатоксин),

   - накожно (оспенная вакцина),

   - внутрикожно (БЦЖ),

   - внутримышечно (вакцина АКДС),

   - перорально (вакцина против полиомиелита). (Л 4Т.А.0)

   2Мукозальные вакцины0 - вакцины,вводимые не парентерально, а

через рот,аэрозольно,  в инстилляциях (впрыскивание в мочевой

пузырь,влагалище и пр.) Вакцины (с адъювантом) выпускаютсяв

капсулахили микрокаплях.Вакцины вызывают синтез sIg A в ки-

шечнике;в кровотоке появляются антитела классов Ig G и IgA.

/2295к/97/

   5Иммунизация некоторыми препаратами через рот вызывала синтез

5Ig A и sIg A-антител не только в пейеровых бляшках  илистенке

5кишечника, нои  вотдаленных органах - на слизистой бронхов,

5мочеполового тракта.Т.о.,слизистые оболочки действовали как

5единая система,в пределах которой,по-видимому,  происходило

5распространение активированных лимфоцитов и соответствующих ин-

5терлейкинов. /2295к/97/

   5Индукция синтеза Ig A,характерная для мукозального иммуни-

5тета, связана с активацией Тh2 (Т-хелперов второго типа),про-

5дукцией ИЛ-4,5,6 и 10.Активность Тх2 связана и свключением-

5синтеза IgE,  но введение вакцин через рот обычно не вызывает

5развития аллергических состояний. /2295к/97/

   5В слизистыхкишечника и бронхов находятся клетки-супрессоры

5различной природы.В частности, они могут презентировать анти-

5гены, но не образовывать медиаторов,необходимых для размноже-

5ния и дифференцировки лимфоцитов.  Состояние,когдалимфоциты

5получают лишь "первый сигнал", но не последующие, может привес-

5ти к толерантности.Данный механизм необходим,очевидно,для

5того, чтобы защитить слизистые от постоянного воспаления,свя-

5занного с действием ИЛ-1 и ФНО.Все жетакой  типвоспаления

5наблюдается, например, при хроническом рините. /2295к/97/

   5В связи с возможностью развитияиммунологическойтолерант-

5ности вслизистой оболочке кишечника появилось новое направле-

5ние - оральная десенсибилизация при аллергии,  вызванной одним,

5известным веществом./2295к/97-14,39/ Возможная индукция толе-

5рантности заставляет использовать при создании мукозальных вак-

5цин те или иные0 5адъюванты. /2295к/97/

   Варианты мукозальных вакцин

   1. рекомбинантным (см. ныше) с бактериальным вектором.

   2. липосомные и микрокапсулы (скорость деградации до2не-

дель). Использованиилипосомв качестве адъюванта не получило

практического применения. /2295к/

   3. "Корпускулярные" вакцины,например,  адсорбированныхна

эритроцитах цыплят живой вирус гриппа (оральное использование).

/2295к/

                          ВИДЫ ВАКЦИН

   Для профилактики инфекционных заболеваний применяютследую-

щие типы вакцин.

──────────────────┬────────────────────────────────────────────

Группа вакцин     │                      Примеры

по способу        │1Бактерийные вакцины0      │ 1Вирусные вакцины

получения         │и простейших             │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Живые             │-туберкулезная (БЦЖ=BCG -│- коревая,

(аттенуированные) │ Bacille Calmette-Guerin)│- паротитная,

вакцины           │-чумная                  │- гриппозная,

                  │-сибиреязвенная (СТИ-  │- полиомиелитная

                 │ взвесь живых спор)      │  вакцины Сейбина

                  │-туляремийная (вакцина   │- против краснухи

                  │ Гайского-Эльберта)      │- антирабическая

                  │-бруцеллезная│вакцина

                  │-холерная                │- аденовирусная

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Инактивированные│-коклюшная,              │- гриппозная

(или убитые),     │-брюшнотифозная,         │- против клещевого

корпускулярные    │-холерная                │энцефалита

                  │-лептоспирозная          │- полиомиелитная

                  │-гонококковая│вакцина Солка

                  │-бруцеллезная│- против краснухи

                  │- Лизаты /?/, например,│

                  │ при актиномикозе        │

                  │                         │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Химическая        │-сыпнотифозная           │- гриппозная (НА

(субъединичная)   │-холерная (холеро-       │  и NА)

                  │ ген + О-антиген         │

                  │ /ЛПС/)                  │

                  │-менингококковая (ПС А и │

                  │ С)                      │

                  │-брюшнотифозная          │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Синтетические     │Полипептиды бакте-       │Полипептиды виру-

вакцины           │рий, их токсинов         │сов, вакцина против

                  │(вакцина против          │вируса гепатита В)

                  │дифтерийного токси-      │

                  │на, стрептококков)       │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Генноинженерные   │-АГ стрептококков,       │АГ нуклеокапсида

(рекомбинантные)│-липопротеин Pseu-       │- ВГА (вируса гепа-,

вакцины           │domonas aeruginosa,      │  тита А)

                  │-фимбрии кишечной        │- ВГВ (HBsAg)

                  │ палочки,                │- вируса Dengue 4

                  │-ЛПС Vibrio choleraе     │- белки вируса

                  │-О-антигены шигелл       │бешенства

                  │ S.sonnei,S.flexneri     │- Белки вирусов RSV

                  │-АГ возбудителей         │HIV (ВИЧ)

                  │ столбняка,              │

                  │-АГ туляремийных         │

                  │ бактерий,               │

                  │-белки Brucella          │

                  │ abortus,                │

                  │-мембранный белок        │

                  │ Bordetella pertus-      │

                  │ sis (коклюш),           │

                  │-АГ простейших           │

                  │ (Р.berghei,             │

                  │ P.yoelii),              │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Антиидиотипические│Аналоги анатоксинов      │

вакцины           │                         │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Анатоксины        │-Противодифтерийная,     │

                  │-противостолбнячная (АДС)│

                  │-Холероген-анатоксин     │

                  │                         │

──────────────────┴─────────────────────────┴──────────────────

          2Ассоциированные вакцины0 (2поливакцины0 - ВП)

   Для одновременной выработки иммунитета против нескольких ин-

фекций с целью сокращения числа прививок в последние годы  при-

меняют так называемые ассоциированные вакцины, в состав которых

входит несколько моновакцин. (Л 4Т.А.0)

   - Примером ассоциированных вакцин,использующихся в настоя-

щее время, в настоящее время для иммунизации детей являются ши-

рокоприменяемая  во всем мире АКДС-вакцина,а также паратит-

но-коревая и краснушно-паротитно-коревая вакцины, применяемые в

ряде зарубежных стран. (Л 4Т.А.0)

   - Например,  ВП-4 (вакцина без адъюванта, разработанная Инс-

титутом вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова, Москва) содержит

растворимыеАГ  St.aureus,Kl.pneumoniae,Proteus  vulgaris,

E.coli. Используется для лечения хронических инфекционных забо-

леваний дыхательной системы (в т.ч. микробно-обусловленной аст-

мы). /2295к/

   - Бронхомунал (ВП) /используется перорально/. /2295к/

   - Вакцина бронховакс содержит антигены Diplococcus oneumoni-

ae, Haemoph.   influenzae,   Neisseriacatarralis,St.aureus,

Str.pyogenes, Str.viridans. /2295к/

   2Аутовакцины0, полученные из микробной культуры больного (нап-

ример, при хронических стафилококковых инфекциях, гонорее и др.)

{Быстро эволюционирующие микробы - вирусы гепатитов, ВИЧ, грип-

па; меняющие АГ + гонококки, боррелии.]

   2ДНК-вакцины0 (плазмидные) стимулируют клеточный иммунитет(но

не гуморальный). 4При введении некоторых ДНК-вакцин в организм не

4экспрессировался закодированный в ДНК белок и не синтезировались

4АТ.Одновременно с этим имела место индукция весьма выраженного

4клеточного иммунитета. /2579к/99/0

          Классификация вакцин по способам получения

    _2Живые (аттенуированные = ослабленные) вакцины

   1) Жизнеспособные микробы, несущие "свои" АГ

   2) - " - ,несущие АГ другого вида микроба ("химеры"), соз-

данные генноинженерным путем (векторы). 5- см. ниже

    Живые аттенуированные препараты вызывают вакцинальныйпро-

цесс, идентичных инфекционному, иногда с некоторыми клинически-

ми проявлениями. (Л 4Т.А.0)

   В соответствиис требованиями ВОЗ _живая вакцина. должна быть

   - непатогенной (специфически безопасной) для человека,

   - стабильной,

   - защищать от пенетрации и размножения в клеткахкишечника,

- создаватьзащиту от заражения вирулентным штаммом,

   - нести один или более маркеров для идентификации вакцинного

штаммасреди  дикихкультурв организме хозяина и окружающей

среде. /1365к/

   _Достоинства живых вакцин

   - Создают напряженный иммунитет, сходный с инфекционным.

   - Достаточно однократной вакцинации, так как вакцинный штамм

может размножаться и персистировать в организме.

   - Для  иммунизации необходимы гораздо меньшие количества жи-

вой вакцины. /1633к/

   _Недостатки живых вакцин

   - Антирабическая вакцина иногда вызывает энцефалит (мозговые

АГ).

   - Применение  живых вакцин опасно для людей (особенно детей)

с врожденными или приобретенными ИД=ми состояниями, на фоне ко-

торых возбудители с пониженной вирулентностью могут вызвать тя-

желую генерализованную инфекцию (например, паралитический поли-

омиелит при агаммаглобулинемии).

   - Сохраняетсявероятность  обратноймутации и приобретения

вирулентных свойств.

   Противопоказание кприменению  - первичное иммунодефицитное

состояние,иммуносупрессия,злокачественныеновообразования,

беременность.

   2Убитые вакцины

   готовят из микроорганизмов,обладающих максимально выражен-

ной иммуногенностью,инактивированных прогреванием, УФ-лучами,

химическими веществами (формалином,фенолом,спиртом и др.) в

условиях, включающих денатурацию АГ-ов. /1430к/

   _Недостатки

   - Меньшая иммуногенность

   - Необходимость повторного введения

   - Использование адъювантов

   - Аттенуированных или убитыйвозбудитель  -этомножество

различных антигенных детерминант, из которых "протективностью",

т.е.способностью индуцироватьзащитный  иммунитет,обладают

очень немногие. Необходима очистка от токсичных, индифферентных

и аллергизирующих компонентов.

   _5Цельновирусные вакцины

   4Цельновирусные вакцины содержат помимо нужных НА и NАтакже

4липиды, повинныев пирогенных,токсических и реактогенных эф-

4фектах при проведении прививок.Наличие липидовнепозволяет

4увеличивать дозировку антигенов, т.к. немедленно ухудшается пе-

4реносимость прививки.

   2Субъединичные вакцины

   Состоят из фракций цельных убитых микробов (ЛПС,токсинов и

др.).

   _Достоинства

   - наименее реактогенны

   - моновалентны

   - 2Аллерговакцины0 - конъюгат аллергена и полиэлектролита (по-

лиоксидония)снижает аллергенную активность,что способствует

индукции "блокирующих" Ig G-антител. /2327к/97/

   _Недостатки

   - наименее иммуногенны; используются с адъювантами

   - необходимость дробного введения. /1430к/

   Более иммуногенными следует считать вакцины субъединчиные из

белков микроорганизмов, полученных с помощью генной инженерии и

синтетические пептидные вакцины. (Л 4Т.А.0)

   - 2Рибосомальные вакцины

   Рибосомальная вакцина   -  рибосомальнаяфракциямикробов,

включающая антигены.Препарат рибомунил (мукозальнаявакцина)

включаетрибосомальную фракцию из культур Klebsiella pneumoni-

ae, Diplococcus pneumoniae, Str. pyogenes, Haemophilus influen-

zae. /2295к/

   Рибосомальная вакцина - микробная вакцина;у одних микробов

(шигелл)основную иммуностимулирующую (антигенную) роль играют

белковые компоненты, у других микробов - РНК.

   30 лет назад открылииммуностимулирующиесвойства  рибосо-

мальной вакцины - рибосомы выступают в качестве адъювантов.

   Это естественная комплексная (случайный комплекссдругими

мембранными структурами, на которых есть АГ) вакцина.

   2Генноинженерные (рекомбинантные)0 2вакцины

созданы на основе картирования геномов микробов.Гены, контро-

лирующие нужные антигенные детерминанты, переносят в геном дру-

гихмикробов  и клонируют в них,добиваясь экспрессии генов в

новых условиях. /1430к/

   Рекомбинантные вакцины - микроносители + белковый антиген+

адъювант (холерныйтоксин и пр.).В качестве векторов в живых

рекомбинантных вакцинах используются малопатогенные  сальмонел-

лы, аденовирусы, полиовирусы, вирус Vaccinia. Такие вакцины вы-

зывали развитие как местного,так и системного иммунитета, ха-

рактеристика   которого  зависелаотиспользованноговектора

(Табл.). /2295к/

   - Например,  вирус Vaccinia c протективным белком  Gвируса

бешенства размножается в кишечнике и вызывает местный и систем-

ный иммунныйответ;  аденовирус c протективным белком G вируса

бешенства лучше размножается в легких(аэрозольноевведение).

/2295к/

   - Малопатогенную Salmonella typhimurium используют в качест-

ве бактериальноговекторакак  носителяповерхностного белка

лейшманий (gp63), а также белка С тетанотоксина. /2295к/

Рекомбинантные оральные вакцины /2295к/

───────────────┬───────────────────────────────────────────────

   Векторы     │                Антигены

───────────────┼───────────────────────────────────────────────

S.typhi        │Поверхностный белок Str.mutans

               │

S.dublin       │Липопротеин Pseudomonas aeruginosa

               │Фимбрии кишечной палочки

               │ЛПС Vibrio cholerae

               │

S.typhi        │О-антигены шигелл (S.sonnei, S.flexneri)

               │

S.typhimurium│Антигены возбудителей столбняка,

               │туляремии,

               │белки Brucella abortus,

               │Str.major,

               │M-белок Str.pyogenes,

               │мембранный белок Bordetella pertussis,

               │простейших (Р.berghei, P.yoelii),

               │вирусов нуклеокапсида

               │- ВГА,

               │- ВГВ,

               │- вируса woodcbuek hepaitis,

               │поверхностный антиген вируса Dengue 4.

               │

Adenovirus     │Белки вируса бешенства

Vaccinia virus │Белки вируса бешенства, RSV, HIV, HBsAg

Polio virus    │Белки вируса HIV

Е.с.           │

───────────────┴───────────────────────────────────────────────

   2Химические (синтетические) вакцины

представляют собой искусственно синтезированные короткие пепти-

ды, имитирующие небольшие структуры оболочки вирусов,  бактери-

альныхструктур (т.е.они моделируют природные аналоги,но в

отличие от них не содержат "баластного материала",  которыйне

существенен для создания иммунитета,а лишь загрязняет матери-

ал. (Л 4Т.А.0)

   Можно использоватькомплекс  выделенных в чистом виде анти-

генных детерминант (эпитопов), конъюгировать с носителем (поли-

электролитом, белком и ввести подобную искусственную вакцину в

организм. /1430к/

   2Антиидиотипические вакцины

   - вакцины на основе антиидиотипических антител,которые яв-

ляются "внутренним образом" АГ и тем самым  могутвводитьсяв

организм вместо АГ патогенных микробов.Показано, что антитела

против антитоксического Ig могут иммунизировать подобно анаток-

сину. (Л 4Т.А.0)

                2Виды побочного действия вакцин

   2Недостатки

   Вакцинация - одно из крупнейших достижений биологии.Однако

техника вакцинации до сих пор несовершенна. Самое гласное - не-

возможно гарантировать абсолютную безопасность вакцины.

   1. _1Фармакологическое действие вакцин

   Вакцины могут влиять на работу сердца, легких, почек, эндок-

ринной, нервнойсистем и пр.  ЛПС коклюшного ЛПС может вызвать

лихорадку, судорожный синдром, энцефалопатию. /2259к/95/

   Вакцины вызывают образование различных медиаторов. Например,

ИФ вызывает лихорадку, гранулоцитопению и токсические явления в

ЦНС, ИЛ-1 является одним из факторов воспаления. /2259к/95/

   2. _1Поствакцинальный инфекционный процесс, вызванный

   - _1остаточной вирулентностью вакционного штамма;

   Например, лимфадениты иостеомиелиты  послевведенияБЦЖ.

Вакцино-ассоциированный полиомиелит, корь. /2259к/95/

   - _1реверсией патогенных свойств вакцинного штамма

   3. _1Туморогенное действие

   Используемые длябиотехнологии  (получения   рекомбинантных

вакцин, препаратов)материалымогут быть контаминированы раз-

личными вирусами и микоплазмами. Для контроля препаратов приме-

няются современные методымолекулярногоанализа  (определение

содержания ДНК,аминокислотной и нуклеоидной последовательнос-

ти,методы молекулярной гибридизации с применение цепной поли-

меразной реакции и др.). /2259к/95/

   Присутствие впрепаратах  гетерологичной ДНК в большой кон-

центрации представляет онкогенную опасность,так как ДНК может

вызывать инактивациюсупрессорных онкогенов или активацию про-

тоонкогенов после ее интеграции с клеточным геномом.По требо-

ваниям ВОЗ,содержание  гетерологичной ДНК в 1 дозе вакцины не

должно превышать 100 пг,а для препаратов ИФ иМАТ,  вводимых

людям многократно,оноустанавливается в каждой стране нацио-

нальным контрольным органом. /2259к/95/

   4. _1Индукция образования антител кнепротективнымантигенам

_1вакцин

   Число антигенных детерминант в одной вакцине может достигать

нескольких десятков.Лишьнебольшая  частьэтихдетерминант

обеспечивает развитие антиинфекционного  иммунитета.Остальные

антигены вызывают продукцию АТ-свидетелей,не играющих сущест-

венной роли в становлении иммунитета.Такую бесполезную работу

ИС выполняет при введении многокомпонентных вакцин,  рассчитан-

ныхпреимущественно   на   создание   клеточного   иммунитета.

/2259к/95/

   5. _1иммуномодулирующее действие вакцин.0:

   - _1действие антигенов вакцин

   Многие возбудители (БЦЖ. коринебактерии parvum, B.pertussis,

Nocardia, L.monocytogenes) и бактерийные препараты (пептидогли-

каны, ЛПС,белок А и др.) обладают ярко выраженнымнеспецифи-

ческим иммуномодулирующими свойствами, влияющими на развитие ИО

к другим АГ.Например,  В.pertussis влияет к  опустошениюти-

мус-зависимых зон лимфоидной ткани.Этот возбудитель усиливает

активность макрофагов,Т-хелперов и Т-эффекторовиподавляет

активность Т-супрессоров. /2259к/95/

   - _1действие сорбента, носителей и др.;

   - _1действие цитокинов, присутствующих в вакцинах

   Многие цитокины,например,  ИЛ-1,ИЛ-6,гранулоцитарный и

гранулоцитарно-макрофагальный КСФ(ГМ-КСФ),могут присутство-

вать вполиомиелитной,антирабической,коревой,  паротитной,

краснушной вакцинах.Такие цитокины, как ИЛ-1, ФНО, могут при-

сутствовать в МАТ. /2259к/95/

   6. _1Индукция аутоиммунных состояний

   а) При наличии перекрестных АГ у микробов (с АГ человека)

   Например, перекрестныеАГ между полисахаридом менингококко-

вой В-вакцины и гликопротеином клеточных мембран млекопитающих.

/2259к/95/

   б) При наличии перекрестных АГ примесей и АГ человека.

   Примеры для сравнения:

   - вирус (вакцина), выращенный на культуре клеток почек чело-

века и хомяка,

   - вирус (вакцина),выращенный на культуре клеток фиброблас-

тов,

   - вирус (вакцина), выращенный на культуре опухолевых клеток

   - др.

   7. _1Аллергия.0:

   - _1к антигенам вакцин

   Столбнячный анатоксин способен вызывать атопию (одникомпо-

ненты - атопию, другие - ГЗТ).

   - _1к примесям и добавкам

   Большинство вакцин содержат различные примеси и добавки: ге-

терологичный белок,консерванты, ростковые факторы, стабилиза-

торы, сорбенты и др.Они могут быть причиной побочных реакций,

прежде всего аллергических осложнений. /2259к/95/

   Значительную опасность представлет примесь чужеродного белка

(яичный альбумин,БСА и др.) в вакцине.Такой белок входитв

состав большинства вирусных вакцин. По требованию ВОЗ, гриппоз-

ная вакцина должна содержать овальбумина не более  5мкг/доза,

/2259к/95/ Пример для сравнения: вирус, выращенный на курином и

гусином эмбрионе. Кильковый бульон (МПБ).

   Ранее в некоторые вакциныдобавляли  стрептомицин,который

вызывал тяжелыеаллергические реакции вплоть до анафилактичес-

кого шока. В настоящее время используются антибиотики со слабы-

ми аллергенными свойствами. /2259к/95/

   В качестве инактиваторов и консервантов вакцин применяют фе-

нол, формальдегидимертиолят.  Побочные реакции на мертиолят

возникают редко. /2259к/95/

   - _1к экзоаллергенам, не связанным с вакциной

   Вирус гриппа А усиливает выделение гистамина нааллергену

больных аллергией. /2259к/95/

   8. _1Индукция иммунодефицитных состояний

   Микробные АГ способны активировать клетки-супрессоры,вызы-

вать выделение супрессорных факторов из этих  клеток,секрецию

Pg E420 из макрофагов и т.п. /2259к/95/

   9. _1Психогенное действие вакцин

   Ярко выраженные психоэмоциональные свойства прививаемого мо-

гут усиливать местные и общие реакции вплотьдообморока  при

инъекции вакцины./2259к/95/

                      3Календарь прививок

   Для достижения желаемого иммунитета при проведенииактивной

иммунизации большое значение имеют реакции инокулирования анти-

гена, т.е. наличие определенных интервалов между его введением.

Соблюдение этого правила важно с 2 точек зрения:

   - организм человека,находящийся в процессе иммуногенезав

результате введения прививочного антигена, в течение определен-

ного времени не способен ответить на новоенаслаиваемоеанти-

генное раздражение развитием иммунитета (отрицательная фаза им-

мунитета)(Л 4Т.А.0);

   - вакцинация  организма,находящегосяеще в начальной фазе

иммунологической перестройки,под влиянием предшествующей вак-

цинации может вызывать повышенные реакции и осложнения.(Л 4Т.А.0)

   Активная иммунизация не обуславливает у всех прививаемых де-

тей одинаковую степень невосприимчивости. Существуют группы де-

тей, которые не способны квыработкеантител.  Поэтомуочень

важным являетсяиспользование для иммунизации оптимального мо-

мента для ребенка в целях получения высокого  иммуностимулирую-

щего эффекта. (Л 4Т.А.0)

   Поскольку активная иммунизация вызывает выработку иммунитета

лишь после определенного периода ...

   В соответствии с принятым календарем профилактических приви-

вок вакцинация детского населения проводится в 2 направлениях:

   - массовая вакцинация и

   - вакцинация отдельных групп (по специальным показаниям). (Л

4Т.А.0)

   К первой относятся профилактические прививки против туберку-

леза, полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, кори, пароти-

та, гриппа;ко второй - против брюшного тифа,холеры, туляре-

мии, бруцеллеза,сибирской язвы, лептоспироза, чумы, лихорадки

Ку, клещевого энцефалита. (Л 4Т.А.0)

                                             Утверждено приказом

                                             N 375

                                             от 18.12.1997г.

              Календарь профилактических прививок

                      детям и подросткам

──────────┬───────┬───────────────────────┬────────────────────

Вид вакци-│ Сроки │   Сроки ревакцинации│     Примечание

нации     │ вакци-├──────┬──────┬─────┬───┤

          │ нации │   1  │   2│  3│ 4 │

──────────┼───────┼──────┼──────┼─────┼───┼────────────────────

Вакцина   │ 1 сут.│1-ый│5-6   │     │   │- Первая схема

против    │(ново- │месяц │месяц │     │   │

гепатита В│рожден-│      │      │     │   │

          │ным)   │      │      │     │   │

          │       │      │      │     │   │

- " -     │4-5    │5-6   │12-13 │     │   │- Вторая схема

          │месяц│месяц │месяц │     │   │

          │       │      │      │     │   │

Против    │ 4-7   │ 6-7  │14-15 │     │   │Вакцинацию и ревак-

туберкуле-│дней   │ лет  │лет   │     │   │цинацию проводят

за (БЦЖ   │       │ (1   │(8-9│     │   │однократно. (противо-

или БЦЖ-М)│       │класс)│класс)│     │   │показания - вес ре-

          │       │      │      │     │   │бенка менее 2000 кг,

          │       │      │      │     │   │келлоидных рубец пос-

          │       │      │      │     │   │ле предыдущей дозы)

          │       │      │      │     │   │

Против    │3 мес. │18 мес│2 года│6 лет│ 11│Вакцинация может про-

коклюша,│4 мес. │(через│мес.│(АДС-│лет│водиться одновременно

дифтерии и│5 мес. │12-18 │(ОПВ) │М,   │(АД│с вакцинацией против

столбняка │       │мес.│      │ОПВ) │-М)│полиомиелита.

(АКДС),ОПВ│       │после │      │     │16,│Далее - 16-17 лет

-оральная │       │закон-│      │     │26,│(АДС-М), взрослые

полиомие- │       │ченной│      │     │36,│(АДС-М или АД-М)

литная    │       │вакци-│      │     │46,│однократно каждые 10

вакцина   │       │нации)│      │     │лет│лет.

          │       │      │      │     │   │Противопоказание -

          │       │      │      │     │   │прогрессирующие забо-

          │       │      │      │     │   │левания нервной сис-

          │       │      │      │     │   │темы, афебрильные

          │       │      │      │     │   │судороги в анамнезе

          │       │      │      │     │   │(вместо АКДС вводят

          │       │      │      │     │   │АДС)

          │       │      │      │     │   │

Вакцина   │12-15  │6 лет │      │     │   │Противопоказания:

против    │месяцев│      │      │     │   │тяжелые реакции на

кори,     │       │      │      │     │   │аминогликозиды,

паротита и│       │      │      │     │   │анафилактические

краснухи│       │      │      │     │   │реакции на яичный

          │       │      │      │     │   │белок.

──────────┴───────┴──────┴──────┴─────┴───┴───────────────────

   Примечания:

   - Ревакцинациявакциной БЦЖ проводится неинфицированным ту-

беркулезом детям.

   - Вакцинация против кори, эпидемического паротита и краснухи

проводится моновакцинами или тривакцинами (корь, краснуха, эпи-

демический паротит)

   - Для проведения последующих прививок минимальный интервал -

4 недели.

   _Противопоказания.:

   - Сильная реакция или осложнение на предыдущую дозу (наличие

температуры выше 405о0С, отек, гиперемия больше 8 см в диаметре в

месте введения вакцины, реакция анафилактического шока).

   - Первичное   иммунодефицитноесостояние,иммуносупрессия,

злокачественные новообразования,беременность (для всехживых

вакцин).

     2Календарь прививок в эндемичных, зоотипичных районах

                 2и по эпидемическим показаниям

──────────┬───────────┬────────────┬────────────────────────────

Вид вакци-│Сроки      │Сроки       │       Примечание

нации     │вакцинации │ревакцинации│

──────────┼───────────┼────────────┼────────────────────────────

Против    │С 2 лет    ││

чумы      │           ││

          │           ││

Против    │С 7 лет    │Через каждые│

туляремии │           │5 лет       │

          │           ││

Против    │С 18 лет   │Через 1 год │

бруцеллеза│           ││

/?/       │           ││

          │           ││

Против    │?          │Через 1 год │Только профессиональным

сибирской │           ││контингентам

язвы      │           ││

          │           ││

Против    │С 7 лет    ││

лептоспи- │           ││

роза      │           ││

          │           ││

Против    │С 14 лет   ││

лихорадки │           ││

Ку        │           ││

          │           ││

Против    │С 4 лет    │Ежегодно на │

клещевого │           │протяжении│

энцефалита│           │3 лет       │

          │           ││

Против    │С 7 лет    │Через 2 года│

брюшного│           ││

тифа      │           ││

          │           ││

Против    │С 3 лет    ││Лицам, относящимся к

гриппа    │           ││группе повышенного риска

          │           ││

Против    │С 9 месяцев││Лицам, выезжающим в

желтой    │           ││зарубежные страны,

лихорадки │           ││эндемичные по этой

          │           ││инфекции

          │           ││

──────────┴───────────┴────────────┴────────────────────────────

                       2ИММУНОКОРРЕКТОРЫ

   3Иммунопрофилактика (иммуностимуляция)2 0- профилактика у имму-

нокомпрометированных индивидов (например,до сезонного подъема

заболеваемости) сиспользованиемвитаминов,   микроэлементов,

адаптогенови  препаратов,нормализующихобменные  процессы.

/1652к/

   3Иммунокоррекция (иммунореабилитация)2 0- это в известноймере

иммуностимуляция илииммуносупрессия у людей без видимого про-

явления патологии и убольных,с  возможностьюрегулирования

этих процессов или при помощи дозировки препаратов или и комби-

наций. /1652к/

   35% больных нуждаются в иммунокоррекции.Правильнаяоценка

состоянияиммуной системы необходима для грамотной иммуномоду-

ляции и иммунопрофилактики больных.

   Иммунокорректоры: метилурацил, пентоксил, левамизол, аскору-

тин, препараты кальция в возрастных дозировках. /1629к/

   3Иммунотерапия0 -терапевтические мероприятия у лиц с опреде-

леннной патологией с использованием препаратов крови,  аутовак-

цин, различных аллергенов, аллергоидов и др. /1652к/

   2Иммуномодуляция0 - термин,отражающий работы по исследованию

препаратов сразнонаправленным эффектом в зависимости от доз и

схем. /1652к/

   Проблема в отсутствии строгоселективных  иммуномодуляторов

(повсеместно используют препараты общего действия), практически

полном отсутствии для клинического использования  иммуномодуля-

торов селективного действия на отдельные звенья иммунной систе-

мы, на конкретные популяции и субпопуляции лимфоидных клеток. А

в отношениивлияния  на специфические клоны лимфоцитов практи-

чески нет даже научных разработок. /2157к/97/

   Т.о., в  современныхклиническихусловиях  речь может идти

лишь о "грубом" выявлении иммунологических нарушений и о назна-

чении больнымболееили  менее профильных иммунокорригирующих

препаратов общего действия. /2157к/97/

   _По происхождению. (действия на разные звенья ИС):

   1. Биологические (растительные экстракты;препараты,выде-

ленные из организма человека,крупного рогатогоскота/крс/,

морских животных;препараты из крови и их других биологических

жидкостей),

   - иммуноглобулины (крови, молока женщин и сельскохозяйствен-

ных животных: чагоин, лактоглобулин и др.)

   2. Микробные (выделенные из микроорганизмов: вакцины и пр.),

   - колибактерин, бифидумбактерин,

   - пирогенал, продигиозан, сальмозан,

   - биоцил, иском, кукумариозид и др.

   3. Синтетические (синтезированные искусственно). /1652к/...

   _По природе. ("избирательность" действия препаратов):

   1) полисахариды

   2) вакцины (BCG, ССВ, MRV, полиомиелитная вакцина ...),

   3) препараты НК, синтетические полинуклеотиды,

   4) производные имидазола,

   5) ИФ, тимозин,

   6) гормональные средства

   7) витамины

   8) средства нейромедиаторного действия. /1652к/

   Ни один препарат неоказывает  избирательногодействияна

клетки, участвующие в иммунном ответе. /1652к/

   Иммуномодулирующие свойстваприсущи  ибиогенным   аминам.

Большие гранулярные лимфоциты способны депонировать и высвобож-

дать биогенные амины.Макрофаги могут способствовать депониро-

ванию гистаминаи серотонина в лимфоцитах из окружающей среды.

/1674к/

   _По механизму действия:

   1. препараты,действующие на клеточную кооперацию(преиму-

щественно на Т- или В-систему): Т-активин, миелопид, левамизол,

диуцифон и др.

   2. препараты, действующие на иммуно-нейроэндокринную регуля-

цию (медиаторы,нейропептиды, гормоны, цитокины): лейцин-энке-

фалин, субстанция Р, нейротензин и др.

   3. препараты экстра (транс) иммунного типа действия (адапто-

гены, витамины,микроэлементы, коферменты, препараты, влияющие

на восполнение пластических и энергетических ресурсов):

   - элеутерококк, женьшень, экстракт левзеи (адаптогены)

   - рибоксин,  оротат калия, линетол, штарк-протеин, политабс,

изопринозин,

   - ундевит, декамевит, токоферол, кобаламид и др.

   4. препараты с неизвестным механизмом действия:

   - димиколат,  проксанол268,бонафтон,  АДА202-718 и др.

/1652к/

   Можно выделить группу "ретропрепаратов",имеющих длительную

историю использованияв практике без учета их иммуномодулирую-

щих свойств (аспирин, теофиллин, кофеин, фенамин и др.). /1652к/

.

              2ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА

   До исследования собственных компонентов иммунной системы сле-

дует оценить фагоцитарную и комплементарную активность.

                              АГ

                               │

                         Фагоцитоз (АПК)

                               │

                  HLA4II0        │      HLA4I+II

           ┌──────Тх/Тs────── 3ИО0 ─────Тх/Тs───────┐

          АТ                                      Тк

      3Гуморальный                             Клеточный

      3иммунитет                               иммунитет

           │                                      │

   4┌──────0ИК4──────┐0                         клетка-мишень (КМ)

   │         Активация комплемента                │

   │         (ИК-С1q, ИК-С3в)                   Лизис

   │              │                               │

Фагоцитоз    Фагоцитоз через                  Фагоцитоз

через FcR    комплементарные                  мертвой

             рецепторы                        клетки

__________________________________________________________/

      _При фагоцитарной недостаточности. преципитаты ИК-ов,

    деструктированные клетки активируют свертывающую систему

     и при истощении (общем или локальном) антикоагулянтов

        развивается тромбофилия (_склонность к тромбозам.)

   Т.о. основнойфактор,  определяющий элиминацию из организма

чужеродных и собственных неполноценных субстанций  -фагоцитоз

(полноценный завершенный эндоцитоз).Поэтомуоценку  иммунного

статуса следуетначинать с лейкоцитарной формулы,общего коли-

чества лейкоцитов,_оценки фагоцитарной активности. (степениза-

вершенности по НТС-тесту) и как отражение гуморального иммуните-

та (степень растворения ПИК и утилизации из кровотока ИК) -  ак-

тивность _системыкомплемента..Стимулировать  иммуннуюсистему

(использовать иммуностимуляторы) при недостаточности по  системе

комплемента нельзя,так как лишние ИК (при избытке АТ) не будут

элиминироваться из кровотока.[Физиологический механизмданной

регуляции -фрагменты  С3регулируютсозревание В-лимфоцитов,

т.е. при недостатке С3 синтез АТ "прекращается",так как утили-

зации ИК не будет.]

       ОЦЕНКА ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА

   - Определение абсолютного (камера Горяева) иотносительного

     (мазок) числа нейтрофилов и моноцитов.

   - Определение фагоцитарной активности;

     -- оценка функциональной активности макрофагов (хемотакси-

     са, стадий фагоцитоза и его завершенности, внутриклеточной

     инактивация Staphylococcus aureus, тест кожного окна),

   - Определение общей гемолитической активности комплемента.

     Количественноеопределение  компонентовкомплементаС3,

     С6-С8, субкомпонента С1q.

   - Количественное определениеЕКК,определение активности ЕКК.

   - Тест торможения миграции лейкоцитов наФГА  илицитокины

активированных определенным антигеном лимфоцитов.

                ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ

   Фагоцитозом называется поглощение клетками микробов иличу-

жеродных частиц.Снижение числа нейтрофилов ниже 25%от нормы

опасно для жизни. /2269к/

             ┌─после комплементарного лизиса ─── АПК, КПК ── АТ

   Фагоцитоз ┼─после "работы" антител (ИК)   ─── уровень АТ

             └─комплексов с фибронектином,альфа-2-макроглобу-

               лином, С-РБ, лектинами и пр.

   Для изучения  поглощенияиспользуютбактериальные   клетки

(St.aureus или E.coli), дрожжи, латексные частицы. Более интен-

сивно фагоциты поглощают чистицы,обработанные сывороткой, со-

держащей опсонины (Ig G,комплемента, фибронектин, СРБ и др.).

/2291к/

   При определении фагоцитарной активности определяют следующие

2показатели:

   - фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих нейтрофи-

                           лов к общему количеству нейтрофилов;

   - фагоцитарный индекс - среднее число микробных тел,захва-

                           ченных каждой клеткой;

   - опсонический индекс

   - переваривающаяспособность  -постепенное уменьшение ( в

течение 50-60 минут) интенсивности окрашивания фагоцитированных

микробов вплоть до их полного обесцвечивания;

   - завершенностьфагоцитоза  - отношение лейкоцитов с завер-

шенным фагоцитозом к общему числу лейкоцитов с фагоцитированны-

ми микробами, выраженное в процентах. /272-53/

   _2Методики.1:

   Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro

и в условиях in vivo.

   I. In vitro.

   - Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК;

   - Радиометрические методы изучения стадии захвата.

   - Тест  восстановлениянитросинеготетразолия.  По реакции

восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции  гек-

созомонофосфатного шунта. /1583-4/

   II. In vivo.

   Белым мышам вводят в/бр.2мл стерильного МПБ, чем вызывают-

локальный лейкоцитоз.Через 4 часа в/бр.вводят 1мл  2млрд-ой

культуры Staphylococcusalbus.Через 10-15 минут из перитоне-

альной жидкости готовят мазки (можно из осадка после  центрифу-

гирования), окрашивают метиленовым синим.

   2Незавершенный фагоцитоз0 (наблюдается при поглощении туберку-

лезных палочек,возбудителей лепры,лейшманиоза, гонореи, ме-

нингококков, вирусов, риккетсий) :

   Рис. "Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)"

   Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отно-

шение умерщвленныхи всех поглощенных микробов (примерно равно

0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ):

   - высокая ЗФ (1,0-0,82);

   - средняя (0,81-0,45);

   - слабая (0,44-0,32);

   - очень слабая (0,31-0,29)

   - ЗФ отсутствует (0,28-0,25)

                    2Фагоцитарная активность

                   (фагоцитоз стафилококка)

   Реакцию осуществлялипо  методуН.В.Васильева   и   соавт.

(1972).Для постановки реакции в лунки иммунологического план-

шета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл

цельной крови,взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х

10590 микробных тел/мл суточной агаровой культуры  Staphylococcus

aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2.  В опытные

лунки вводили по 10 мкл расстворовизучаемыхполипептидов,  в

контрольные - 10 мкл фосфатного буфера.  Лейкоцитарно-микробную

взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С втече-

ние 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкуба-

ции взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 ми-

нут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

   Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной

иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах.  Поглотительную спо-

собность фагоцитов оценивали по следующим показателям:

     1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших кле-

ток из числа сосчитанных нейтрофилов;

     2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощен-

ных одним активным нейтрофилом.

     Для оценки  переваривающейфункции нейтрофилов определяли

показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле:

             общее количество переваренных микробов

     ПЗФ  =  -------------------------------------- х 100 %.

             общее количество поглощенных микробов

   Чувствительным методомоценки функциональной активности фа-

гоцитов являетсяметодопределения  хемилюминесценциикрови.

/7062/

   - Приготовитькровяно-микробнуювзвесь (0,05мл 2%цитрата

натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микро-

кокков);

   - для определения опсонического индекса в опытную пробудо-

полнительно добавляетяантисывороткак микробам или сыворотка

больного для определения функциональной  активностиантителк

микробам;

   - выдержать в термостате 30 мин. при 37500С.

   - приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси;

   - высушить  мазок,окрасить по методу Филлипсон:краситель

Романовского развести этиловым спиртом 1:3.На высушенный пре-

парат наносят5 капель красителя и выдерживают 5 минут (однов-

ременная фиксация и окраска).Не сливая краску,добавляют во-

допроводную воду, 5 капель на 5 минут. Промывают водой, высуши-

вают, микроскопируют с иммерсией.

   - В мазке определяют

     а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейко-

        цитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают

        100 гранулоцитов и,например,  если 35 из них водержат

        микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%.

     б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганиз-

        мов,  поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное

        количество микроорганизмов, например, 567 во всех фаго-

        цитирующих гранулоцитах /80/ и делят начисло  фагоци-

        тов.  Частноеотделения  (567:80=7) отражает сруднюю

        поглотительную способность одного фагоцита.

     в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ).Для этого

        либо рассчитывают частное от деления ФЧ(фагоцитарного

        числа) больногона  ФЧздорового донора (при этом ОФИ

        должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпири-

        ческим методом,с помощью которого анализируют состоя-

        ние 25 нейтрофилов по следующей схеме:

──────────────────────────────────────────────────────────────

Количество микро-│Оценка фагоцитоза│Количество нейт- │   ОФИ

бов, фагоцитиро- │                 │рофилов с данной │

ванный одним     │                 │степенью фагоци- │

гранулоцитом     │                 │тарной активности│

──────────────────────────────────────────────────────────────

      0                  0                  2          0х2=0

от 1 до 20         +  (один)                5          1х5=5

от 20 до 40        ++  (два)               10          2х10=20

от 40 и более      +++ (три)                8          3х8+24

                                               Итого:ОФИ=49

   Максимальное значение ОФИ - 75,т.е. во всех 25 нейтрофилах

фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ ра-

вен 10.

    ОФИ  от 10 до 24 - слабо положительный (+);

         от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++);

         от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++).

   Полученые результаты внести в протокол.

   Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%.

   Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?.

   Фагоцитарное число после обработки микробов антителами(им-

мунной сывороткой) или комплементом -

   Опсонический индекс - больше 1.

   Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие

антител идет плохо,при наличии антител в сыворотке или плазме

фагоцитоз ускоряется,при добавлении комплемента или активации

комплемента вкрови  исследуемогофагоцитоз резко ускоряется,

т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

      2Оценка степени перекисного и радикального окисления

                    2по НСТ-тесту0 (NBT-тест)

     1Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

   Тест бессубстратноговосстановлениянитросинего тетразолия

основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с обра-

зованием высокореактогенныхсвободных радикалов.НСТ является

индикатором респираторного взрыва (показывает готовность  нейт-

рофилов к завершенности фагоцитоза).Низкая реактивность нейт-

рофилов в динамике заболеванияможетслужить  неблагоприятным

прогностическим признаком. /2737к/87/

   Сущность метода заключается в образовании нерастворимыхок-

рашенныхзерен  формазана при восстановлении НСТ супероксидным

радикалом.

   Метод высокоинформативен

   - для оценки функциональной активности фагоцитов,

   - прогнозирования тяжести заоблевания,

   - контроля  заэффективностьюантибактериальноголечения,

   - дифференциальной диагностики вирусных и бактериальныхза-

     болеваний и пр. /2291к/

   - Получены доказательства высокого уровнякорреляциимежду

образованием активных форм кислорода и киллингом.

   Метод Н.Е.Виксмана,А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы

веществв  количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического

планшета,в контрольные лунки - 20 мкл среды 199.В каждую из

лунок вносили по 20 мкл цельной крови,взятой из пальца здоро-

вых людей пипеткой,предварительно промытой раствором гепарина

250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетра-

золия (Reanal,Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферномрастворе,

рН 7,2.Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали

при температуре 375о0С в течение 30  минут,встряхиваяпланшеты

каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, гото-

вили мазки и высушивали на воздухе.Готовые мазкификсировали

метанолом10  минут,высушивали и докрашивали 0,5%раствором

сафранина.

   В качестве  активаторов фагоцитов рекомендуется использовать

опсонизированный зимозанилиактиватор протеинкиназы С - фор-

болмиристат ацетат. /2291к/

   Об интенсивности радикалообразования судят по количеству ди-

формазана, которыйоткладывается в виде грубодисперсных темно-

синих гранул внутри или на поверхности активированного  нейтро-

фила./7062/

     При микроскопии в каждом мазке подсчитывали 100нейтрофи-

лов, среди которых определяли процент клеток,  содержащих отло-

жения диформазановых гранул (НСТ-позитивные нейтрофилы).Далее

расчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН) по формуле:

              А х 0+Б х 1+  В х 2+Г х 3

     ИАН  =   ----------------------------------- ,

                              100

где: А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложе-

         ний;

     Б - количество клеток, в которых площадь отложений диформа-

         зана не превышает 1/3 площади ядра;

     В - количество клеток, в которых названные отложения зани-

         мают от 1/3 до всей величины ядра;

     Г - количество клеток с диформазановыми отложениями по пло-

         щади превосходит площадь ядра.

   НСТ-тест можетбыть  сделанбездополнительной стимуляции

(спонтанный НСТ-тест) или после стимуляции нейтрофилов in vitro

(индуцированный НСТ-тест). /7062/

   При патологии чаще ПОЛ растет.Поэтому если лечение выбрано

правильно, то процент активированных нейтрофилов быстро падает,

опережая динамику лейкоцитарных сдвигов, СОЭ и др. /7062/

   Сниженные показателиНСТ-теста --- неблагоприятныйисход

                                       (сепсиса)

Повышенные показатели НСТ-теста --- опасность развития гной-

ных осложнений после операции.

   Нормальные показатели НСТ-теста --- успешная терапия. /1365к/

   [Преципитат с НСТ может образовыватьгепарин. /1575к/90/]

   На стекла с прилипшими клетками капают 5капель  (0,14мл)

1,03% раствора нитросинего тетразолия (17мг на 14 мл).

   (Pack B.I.  и соавт. // Lancet. - 1968. - V.2. - P.532):

   0,2% раствор НСТ (0,1 мл на 0,1 мл взвеси лейкоцитов,выде-

ленных из гепаринизированной крови). Пробирку со смесью помеща-

ли в термостат (375о0С) на 25 минут,затем выдерживали приком-

натной температуре 15 минут,после чего готовили мазки, фикси-

ровали в метаноле и окрашивали гематоксилином. В мазках подсчи-

тывали % гранулоцитов, включающих красители.

               2Лизосомально-катионный тест (ЛКТ)

   Растворами исследуемых полипептидов по 50 мкл заполняли лун-

кииммунологическогопланшета,  вкоторыевносили по 20 мкл

цельной крови здоровыхдоноров,  взятойсоскарифицированной

ранкипальца руки при помощи пипетки,предварительно промытой

раствором гепарина 250 ед/мл.Полученную взвеськлетоккрови

инкубировали 1 час при температуре 37С. После инкубации готови-

ли мазки, сушили на воздухе при комнатной температуре и окраши-

вали по методу В.Е.Пигаревского и соавт. (1981) в 0,1 % забуфе-

ренном спиртовом растворе зеленого прочного с рН 8,2 в  течение

20 минут.Дополнительную окраску мазков проводили 0,25% водным

раствором азура А.Окрашенные препараты промывалидистиллиро-

ваннойводой,  высушивалина воздухе и микроскопировали с ис-

пользованием масляной иммерсии.

     При исследовании просматривали 100 гранулоцитов.Внутрик-

леточное содержаниекатионных белков крови оценивали полуколи-

чественно повеличине  среднегоцитохимическогокоэффициента

(СЦК), вычисляемого по формуле:

             3а  +2б+  1,5в+1г  +0,5д+0а

     СЦК  =  -----------------------------------------,

                              100

где: а-е - количество однотипных клеток с определенной степенью

           окрашиваемости цитоплазмы зеленым прочным, а цифры

           показывают степень выраженности окраски;

     0   - отсутствие окраски;

     0,5 - наличие в цитоплазме единичных окрашенных гранул;

     1   - половина цитоплазмы заполнена светлоокрашенными гра-

           нулами;

     1,5 - цитоплазма равномерно заполнена гранулами,окрашен-

           ными в светло-зеленый цвет;

     2   - цитоплазма содержит 1/3 часть своей площади темно-

           зеленых гранул;

     3   - цитоплазма содержит 2/3 части своей площадитемно-

           зеленых гранул.

       2Определение хемотаксической активности лейкоцитов

   Недостаточный хемотаксиссдерживает  мобилизацию фагоцитов,

способствуя опережающему размножению бактерий.  Снижение мигра-

ционной активности нейтрофилов в 2 раза сопровождается затяжным

торпидным течением пневмонии более чем у 50% детей. /7062/

          ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

                      СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

   _Изотонический вероналовый буфер (VBS)..

   1 л раствора содержит 5,095 г веронала и 41,5 г NaCl, рН до-

водится до 7,40 1 М раствором NaOH. Перед работой буфер разбав-

ляют в 5 раз.

   _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Са52+0 и Mg52+

_(VBS52+0)..

   2 л раствора содержит 5,75 г веронала,3,0 г мединала, 85,0

гNaCl,  5мл1 М MgCl420 и 1,5 мл 1 М СаСl420,рН доводится до

7,40. Перед работой буфер разбавляют в 5 раз.

   _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Mg52+0 и ЭГТА

_(VBS,. _Mg52+0-ЭГТА)..

   К 850  мл изотонического вероналового буфера (VBS),разбав-

ленного в 5 раз, добавляется 100 мл 0,1 М раствора ЭГТА, рН 7,4

и 50 мл 0,1 М раствора MgCl420, рН доводится до 7,40.

   _Изотонический фосфатный буфер (РВS)

   0,85% растворNaCl,  содержащий2%по  объему0,2 М нат-

рий-фосфатного буфера, рН 7,20.

   _Изотонический трис-буферс  ЭДТА(TBSE)..

   Содержит 5 мМ трис, 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТА5.0Na420, рН 7,2 (до-

водится 0,01 М NaOH).

   _Раствор Олсвера..

   В 750 мл дистиллированной воды растворяли 8,0 г цитрата нат-

рия (дигидрата натриевой соли),4,2 г NaCl и 20,0г  глюкозы,

добавляли4~05,5  мл10%лимонной кислоты до рН 6,1 и доводили

объем раствора до 1 л.Для взятия крови раствор Олсвера стери-

лизовали.

   Другие буферные растворы готовили пообщеизвестным  методи-

кам.

   _Приготовление стандартных взвесей эритроцитов

   Эритроциты барана.Кровь  барана из яремной вены отбирали с

соблюдением асептических условийвравный  объемстерильного

раствораОлсвера со стеклянными шариками,перемешивали и сте-

рильно разливали по пробиркам.Оставляли на 3-7 суток при45о0С

для стабилизации клеток.Стерильно отобранные эритроциты можно

хранить около 2 месяцев при 45о0С.

   _Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов..

Осадок эритроцитов трижды промывали 10-20-кратным объемом VBS52+

с последующим центрифугированием (1000 g) в течение  5-10мин.

Отмытые эритроциты суспендировали в VBS52+0 таким образом,чтобы

после 15-кратного разбавления водой суспензия обладала поглоще-

нием при 541 нм равным 0,7, что соответствует концентрации кле-

ток в суспензии 15.010590 клеток/мл.  Для стандартизациипользова-

лись формулой V4k0 = V4o5.0A45410/0,7, где V4k0 - конечный объем суспен-

зии,V4o0 - начальный объем с концентрацией, определяемой по ве-

личинеА45410.Стандартизированные эритроциты хранили при 45о0С и

использовали в работе в течение нескольких суток.

   _Приготовление сенсибилизированных эритроцитов (ЕА)..

   К взвеси  эритроцитов  (стандартизированныхдо1х10590кле-

ток/мл) прибавляли равный объем гемолитической сыворотки,раз-

бавленной VBS52+0 в отношении 1:400, тщательно перемешивали и ин-

кубировали 30 мин при 375о0С, периодически перемешивая. После за-

вершения инкубации взвесь эритроцитов доводили до  концентрации

1,55.010580 клеток/мл,добавляя VBS52+0 таким образом,чтобы 0,2 мл

суспензии ЕА в смеси с 2,8 мл Н420О  давали1,0ед.  оптической

плотности при 412 нм. Стандартизированную взвесь ЕА хранили при

45о0С и использовали в работе в течение одного дня.

   Эритроциты кролика получали, отбирая кровь из ушной вены жи-

вотного в стерильный раствор Олсвера, который постоянно переме-

шивали со стеклянными бусами. Эритроциты хранили в этом раство-

ре при 45о0 до 1,5-2 месяцев. Для стандартизации эритроциты отмы-

валитрижды раствором VBS с последующим центрифугированием при

1000-1500g в течение 5 мин, дважды - раствором VBS, Mg52+0-ЭГТА и

в последнем буфере приготовляли стандартную суспензию таким об-

разом,чтобы при 15-кратном разбавлении дистиллированной водой

(0,2мл  суспензиии 2,8 мл Н420О) она имела поглощение 1,0 при

412 нм.Стандартную взвесь эритроцитов кролика использовалив

работе в течение одного дня.

   Эритроциты барана и кролика более стабильны (менее подверже-

ны спонтанному лизису),если буферы, используемые для стандар-

тизации, содержат 0,1% человеческого сывороточного альбумина.

   _Инактивация комплемента..

   Для проведениясерологическихреакций  системукомплемнта

часто инактивируют при 565о0 30 минут. При этом теряют активность

С2,С4,фактор В,в результате чегопрерывается  активациякак

КПК, так и АПК.

          2Определение общей гемолитической активности

                      2системы комплемента0

   Предложено несколько методов определения уровня комплемента.

   _Классический путь активации системы комплемента. (КПК)опре-

делялипо  методу P.G.Adrian (1983) и S.Tanaka et al.(1986).

Для постановки реакции использовали суспензию эритроцитов бара-

на в концентрации 109 клеток/мл,предварительно сенсибилизиро-

ванных антисывороткой к ним. К 280 мкл веронал-мединалового бу-

фера (рН 7,4), содержащего 5 мМ MgCl2 и 0,75 мМ CaCl2, добавля-

ли 20 мкл рабочей концентрации сыворотки здоровых доноров, раз-

бавленной в том же буфере.Рабочая концентрация сыворотки под-

биралась таким образом,чтобы лизировалось 50-60 % эритроцитов

за 20 минут. В систему вносили 20 мкл раствора исследуемого по-

липептида (контроль- 20 мкл веронал-мединалового буфера). Пробы

инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, пос-

ле чего вносили 200 мкл суспензии эритроцитов барана,  сенсиби-

лизированныхантителами.  Смесьвстряхивали и инкубировали 20

минут при температуре 37С в водяной бане.По истечении времени

реакциюгемолиза  останавливали погружением пробирок в ледяную

баню и разведением системы охлажденным забуференным  физиологи-

ческим раствором (2,5 мл буфера).Эритроциты осаждали при 3000

об/мин в течение 5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли

спектрофотометрическипо оптической плотности супернатанта при

длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыворотку.

   Для определения _альтернативного пути активации. системы комп-

лемента /АПК/ (Козлов Л.В.,Соляков Л.С.,1982;  Tanaka S. et

al.,1986) к 280 мкл веронал-мединалового буфера (рН 7,4), со-

держащего 5 мМ MgCl2 и 10 мМ этиленгликоль-тетрауксусной кисло-

ты добавляли рабочую дозу сыворотки здоровых доноров (20 мкл) и

20 мкл исследуемого полипептида. Смесь инкубировали при комнат-

нойтемпературе 20 минут,а затем добавляли 200 мкл суспензии

эритроцитов кролика в буфере (1,5х1058_0 .клеток/мл).Смесь встря-

хивалии помещали в водяную баню при температуре 37С на 20 ми-

нут.Реакцию гемолиза останавливали добавлением 2,5 млохлаж-

денного до 4С забуференного физиологического раствора,  а затем

содержимое пробирок центрифугировали при 3000 об/мин в  течение

5 минут.Степень лизиса эритроцитов определяли на спектрофото-

метре при длине волны 412 нм против пробы,не содержащей сыво-

ротку.

          Гемолитический метод титрования комплемента

                 2по50%  или0 2100%-му гемолизу

   Титром комплемента является наменьшее количество исследуемой

активности сыворотки, способствующее полному гемолизу добавлен-

ного количества(0,5-1 мл) сенсибилизированных эритроцитов.

   Для титрования комплемента по 100%-му гемолизу активную исс-

ледуемую сыворотку, разведенную в 10 раз, разливают в 11 проби-

рок в количестве 0,1;0,2;0,3;  0,4 ... 1; 1,1 мл. Сыворотку

доводили физиологическим раствором до 1,5 мл, после чего в каж-

дую пробирку добавляют 1 мл гемолитической системы (1,5% взвесь

эритроцитов барана,обработанных антителами вконечном  титре

1:3). Учет результатов производили после 45-минутного инкубиро-

вания взвеси в термостате при 37500С.

   Для расчета  берут пробирку,в которой получен полный гемо-

лиз. Например,полный гемолиз произошел в пробирке N 4 с дозой

активной сыворотки 0,4мл; следовательно, титр комплемента равен

0,04.

   СН4500 -минимальное  количество сыворотки,которое вызывает

лизис 50% сенсибилизированных бараньих эритроцитов, находящихся

в 0,5мл стандартной суспензии при 37500С в течение 30 минут.

         1Количественное определение уровня комплемента

                      1ввесовых3 1единицах

   Среди больных с бактериальными инфекциями(пневмония,сеп-

сис) опсонический резерв альтернативного пути активации компле-

мента нередко в 5-10 раз ниже нормы./7062/ Классическийпуть

более устойчивкнарушениям внутренней среды и менее пригоден

для их регистрации. /7062/ При падении активности АПК до 30% от

среднего уровня взрослых септические проявления пиогенного про-

цесса отмечали у 80% больных. /7062/

2Приготовление реагентов0 для определения

           активности отдельных компонентов комплемента

   _Сыворотка человека..Донорскую  кровьотбирали в сухую сте-

рильную посуду и оставляли на 2 суток при 45о0С.  После этого сы-

вороткукрови сливали декантацией и центрифугировали в течение

20 мин при 3000g.Супернатант разливали по пробиркам и хранили

при -705о0С.

   _Приготовление реагента R2 для определения гемолитической ак-

_тивности компонента С2.. Сыворотку разливали в тонкостенные про-

бирки по 3 мл и инкубироваливводяном  термостатепри505о0С

(внутри пробирок).Отбирали пробы через каждые 10 мин, опреде-

ляя активность компонентов С1, С1q, С4 и контроль на гемолиз по

методикеопределения  С2,используяв качестве R2 отобранную

пробу. В качестве R2 выбирали сыворотку, инкубированную в тече-

ниетакого времени,при котором сохраняется активность компо-

нентов С1 и С4 при достаточно низком контроле.R2 хранилипри

-705о0С в течение года.

   _Приготовление реагента R4 для определения гемолитической ак-

_тивности компонентаС4..К 1 мл комплемента морской свинки до-

бавляли 0,25 мл 0,075 М раствора гидразингидрата, смесь инкуби-

ровали1,5 ч при 205о0 и нейтрализовали добавлением 0,25 мл 0,15

М HCl,после чего диализовали против РВS в течение18  чпри

45о0С.Реагент  хранилипри-705о0С и использовали в качестве R4

после предварительного разбавления VBS52+0 в соотношении 1:3.

   _Приготовление реагента R3 для определения гемолитической ак-

_тивности компонента С3.. К 10 мл охлажденной до 45о0С свежей сыво-

роткипри  непрерывномперемешивании медленно приливали 10 мл

охлажденного насыщенного при 45о0С раствора КВr.  Смесь инкубиро-

вали 18 ч при 45о0С, затем диализовали в течение 18 ч против PBS.

Реагент хранили при -705о0С.В качестве R3 использовали реагент,

разбавленный VBS52+0 в соотношении 2:3.

   _Приготовление реагентаR3.5oxy_0 для определения гемолитической

_активности компонента..

   Реагент R35oxy0готовили  окислением компонента С2 в реагенте

R3.Реагент R3 готовили как описано выше.Окисляющий  раствор

готовилирастворением  8,3г KI и 0,25 г I420 в 4 мл фосфатного

буфера, рН 6, ионная сила 0,1 (105 мл 1 М NaH420PO440 + 35 мл 0,5 M

Na420HPO440+ H420O до 1,5 л),затем доводили объём до 10 мл тем же

буфером.Хранили в темной склянке при45о0в  течениенедели.

Окисляющийраствор (10 мкл) добавляли к 2 мл реагента R3 инку-

бировали 5 мин при 45о0 и нейтрализовали избыток иода добавлением

1мг  глюкозы на 1 мл пробы.Реагент R35oxy0 хранили при -705о0 и

использовали в качестве реагента R35oxy0  послепредварительного

разбавления VBS52+0 в соотношении 1:3.

   _Приготовление реагента R1q с помощью IgG-стекла..

   К 10 мл сыворотки крови человека добавляли 37,2 мг ЭДТА5.0Na420,

осторожно перемешивали на магнитной мешалке до растворения соли

(конечная концентрация 10 мМ) и доводили 0,15 М NаОН до рН 7,2.

Подготовленнуютаким  образомсыворотку наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5х2 см),уравновешенную TBSE,со скоростью  15

мл/ч.Колонку промывали 50 мл TBSE со скоростью 35 мл/ч. Фрак-

ции несвязавшегося на колонке белка (50 мл) не проявляли актив-

ности С1q. Фракции несвязавшегося белка с максимальным поглоще-

нием при 280 нм объединяли (18 мл), добавляли раствор, содержа-

щий 0,3 М CaCl420,1 M MgCl420, pH 7,4, из расчета 15 мкл раствора

на 1 мл фракции, доводили до рН 7,4, диализовали в течение ночи

против VBS52+0, разливали небольшими аликвотами по пробиркам, за-

мораживали и хранили при -705о0С. Использовали в качестве реаген-

та R1q,после размораживания непосредственно перед титрованием

С1q.

   _Получение реагента R1 с помощью IgG-стекла.

   5 мл  охлажденнойсывороткипри  45о0наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5 х 2 см), уравновешенную VBS pH 7,4, содержащим

0,001 М СаСl420, со скоростью 8 мл/ч. Фракции несвязавшегося бел-

ка собирали по 2 мл и определяли остаточную  активностьС1qи

С1r420s420, фракции с максимальным поглощением при 280 нм объединя-

ли (10мл),диализовали против VBS52+0 в течение ночи,разливали

небольшими аликвотами по пробиркам,замораживали и хранили при

-705о0. Колонку IgG-стекло-С1 использовали в дальнейшем для выде-

ления С1q, C1r и C1s.

         1Гемолитические методы определения активности

              1компонентов и факторов комплемента

   _Определение гемолитической активности компонентов С2 и С4.. К

0,2 мл стандартизованной суспензии ЕА в VBS52+0 добавляли 0,05 мл

реагента(R4 или  R2в соответствующем разведении) и 0,25 мл

тестируемой пробы. Смесь инкубировали 30 мин при 375о0, добавляли

2,5мл  0,15МNaCl и центрифугировали при 1500g в течение 5

мин.Степень гемолиза определяли по А44120,измеренномупротив

буфера.Кроме того,  ставили контроли на спонтанный лизис (0,2

мл ЕА и 0,3 мл буфера),а также контроль на полный лизис эрит-

роцитов (0,2 мл ЕА и 2,8 мл Н420О).  Измеренную величину гемолиза

выражали в виде Z (количество эффективных молекул), которую оп-

ределяли по формуле:

                    Z = ln _К4П.Л.5_0 К4R

                           К4П.Л.0- А44120 ,

где К4R0-контроль  реагента (буфер вместо тестируемой пробы),

К4П.Л.0 - контроль на полный лизис эритроцитов, А44120 - измеренное

значение тестируемой пробы.

   _Определение гемолитической активности компонентов С3..К 0,2

мл ЕАС14 (приготовление комплекса описано ниже) добавляли0,05

млреагента (R3 или R5 в соответствующем разведении),0,25 мл

тестируемой пробы и смесь инкубировали при  375о0втечение  30

мин.После инкубации добавляли по 2,5 мл 0,15 М NaCl и центри-

фугировали при 5 мин при 1500g.Степень гемолиза определяли по

поглощениюпри 412 нм,  измеренному против буфера.В качестве

контролей ставили контроль реагента (0,25 мл буфера вместо тес-

тируемой пробы),контроль на спонтанный лизис эритроцитов (0,2

мл ЕАС1 4 и 0,3 буфера) и контроль на полный лизис  эритроцитов

(0,2 мл ЕАС1 4 и 2,8 мл Н420О).Измеренные значения гемолиза вы-

ражали в виде Z аналогично определениюактивностикомпонентов

С2 и С4.

   _Приготовление комплекса ЕАС14..10 мл ЕА (концентрация1х

10590клеток/мл)  инкубировалис 1,0 мл R2 при 375о0 в течение 10

мин. Комплекс промывали VBS52+0 до полного исчезновения фона (ли-

зированныеэритроциты)  споследующимцентрифугированием при

1500g в течение 5 мин.Отмытый комплексстандартизировалидо

концентрации1,5 х 10580 клеток/мл как описано для ЕА.Комплекс

ЕАС14 использовали в работе в течение одного дня.

   _Приготовление комплексаЕАС1q  с ограниченным числом эффек-

_тивных молекул С1q..К 200 мкл суспензии ЕА(1,5  х10580кле-

ток/мл)добавляли  подобранное количество раствора С1q в общем

объеме 300 мкл.Инкубировали 30 мин при 375о0С. Реакцию останав-

ливалиохлаждением  идобавлением 700 мкл охлажденного VBS52+0.

Комплекс промывали 1 раз VBS52+0/HSA и количествогемолитических

эффективных молекул С1q определяли с помощью реагента R1q.

   _Получение комплекса ЕАС14 с ограниченным числомэффективных

_молекул С4b..К 10 мл суспензии ЕА (1,5 х 10580 клеток/мл) добав-

ляли 100 мкл реагента R2 и инкубировали 5 мин при 375о0.Реакцию

останавливали охлаждением до 05о0 в ледяной бане. Комплекс промы-

вали 3 раза VBS/HSA с центрифугированием и  стандартизовалипо

А44120 при гемолизе.Количество гемолитических эффективных моле-

кул С4b определяли с помощью реагента R4.

   _Приготовление стабилизированной мембраносвязанной С3-конвер-

_тазы ЕАС1425oxy.0.К 6 мл суспензии ЕАС14 (1,5 х  10580клеток/мл)

добавлялипри 05о0 180 мкл реагента R35oxy0,30 мкл 0,1 М NiCl420 и

инкубировали 5 мин при 375о0,реакцию останавливалиохлаждением

до05о0в  ледяной бане.Добавляли 4 мл VBS,содержащего ЭДТА

(VBSE) и центрифугировали 5 мин при 1500g.  Полученный комплекс

ЕАС1425oxy0промывали  3раза VBS52+0 и стандартизовали при А44120,

как описано выше.

   _Определение гемолитическойактивности С3-конвертазы..К 0,2

мл суспензии ЕАС1425oxy0 (1,5 х 10580 клеток/мл) добавляли0,1мл

сыворотки, разведенной 1:9 VBS, содержащего 0,05 М ЭДТА (VBSE).

Общий объём доводили до 0,5 мл VBSE и инкубировали 30  минпри

375о0.Реакцию  останавливалидобавлением2,5 мл 0,15 М NaCl и

центрифугировали 5 мин при 1500 g.Степень гемолиза определяли

в супернатанте при А44120.

   _Выделение функционально активных субкомпонентов С1,первого

_компонента комплемента, на аффинном сорбенте..

   20 мл  сывороткикровичеловека  наносилинаколонку   с

IgG-стеклом (9,5 х 2 см),уравновешенную 0,01 М трис-HCl-буфе-

ром с 0,15 М NaCl и 0,001 М СаСl420, рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч

при05о0.После полного нанесения сыворотки протекание раствора

через колонку останавливали и колонку инкубировали с сывороткой

40 мин при 05о0 для полного связывания комплекса С1. Колонку про-

мывали стартовым буфером со скоростью 20 мл/ч, собирая белковые

фракции(А42800)и  определяя в них остаточную активность С1q и

С1r420s420.

   _Получение С1r42.0.Колонкус  IgG-стекломс сорбированным С1

нагревали при 305о0 в течение 40 мин для активации С1. Затем про-

водилиэлюирование  при  05о0стартовым  буферомсо скоростью 20

мл/ч,собирая фракции по 3 мл.В белковых фракциях определяли

активность С1r и С1s.

   _Получение С1s..После элюирования С1r стартовым буфером про-

водили элюирование С1s 0,05 М ЭДТА трис-НСl-буфере,  содержащем

0,15 М NaCl,рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч при 05о0. Фракции, об-

ладающиеактивностью С1s (около 60 мл) объединяли и концентри-

ровали ультрафильтрацией до 5,5 мл.С1s хранили при 45о0 с 0,01%

NaN430 в течение года.

   _Получение С1q..После элюирования С1s субкомпонент С1q элюи-

ровали с колонки с IgG-стеклом 0,02 М трис-НСl-буфером,  содер-

жащим 1,0 М NaCl,0,03 ЭДТА,рН 8,5 со скоростью 20 мл/чпри

05о0.Фракции,  содержащиеактивностьС1q,  объединяли и белок

осаждали сульфатом аммония при 33%  насыщения.Длядальнейшей

очисткиосадок  С1qрастворяли и фракционировали на колонке с

сефакрилом S-300, как описано в работе [48].

         ОЦЕНКА ДРУГИХ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕКОЙ ЗАЩИТЫ

             2Определение ферментативной активности

                     2мурамидазы (лизоцима)

   Записать метод определения лизоцима(ферментативнойактив-

ности мурамидазы).

   В опытную пробирку наливают 0,4мл 0,15М солевогофосфатного

буфера с рН 6,2,добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки крови.

К полученной смеси приливают 2 млстандартизированной(Е=0,66

наФЭК в кювете N 5 при светофильтре N 6) бактериальной взвеси

суточной культуры микрококка в фосфатном буфере. Пробы помещают

в термостатна30 минут при температуре 37500С,  затем замеряют

оптическую плотность на ФЭК в кювете N 2 с  зеленымсветофиль-

тром.

           2Мониторинг законцентрацией фибронектина

   Слежение за  уровнем фибронектина в плазме позволяет прогно-

зировать направленность патологического процесса.  При снижении

концентрации фибронектинадо 100 мкг/мл (при норме 300 мкг/мл)

практически у всех детей развивались тяжелые токсические  синд-

ромы. Для возмещения фибронектина в терапии токсических заболе-

ваний можно использовать криопреципитат (10-15 мл на  инфузию).

Даже однократнаявведение оказывает положительный эффект у 65%

больных. /7062/

              2Определение содержания серомукоида

              (Mejbaum-Kkatzenellenbogen W.,1955)

   К 0,2  млсывороткикрови  добавляют 0,2 мл 0,95%водного

раствора NaCl и 0,9 мл 0,45М сульфосалициловой кислоты. В тече-

ние 30минут  смесь центрифугируют при 1500 об./мин.  К 0,3 мл

надосадочной жидкости дабваляют 0,6 мл физраствора и 4 мл  0,1%

водногораствора танина,перемешвают и помещают на 30 минут в

кипящую водяную баню.Содержимое пробирки охлаждают и измеряют

оптическуюплотность  в кювете с длиной оптического пути 10 мм

на ФЭК при длине волны 590 нм против дистиллированной воды.

   Содержание серомукоидав биологических жидкостях выражают в

единицах оптической плотности полученного раствора.  В нормев

сыворотке кровисодержаниесеромукоида  составляет0,11-0,13

единиц оптической плотности.

                  2Реакция кольцепреципитации

                       определения С-РБ

   Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-

неч треть- исследуемой сывороткой.Капилляр покачивают 12-15

раз для смешивания ингредиантов и устанавливают вертикальнона

пластилиновый штатив.оставляют 24 часа при комнатной темпера-

туре. Помутнение на границе раздела свидетельствуетоналичии

СРБв  кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности

деструктивных процессов в организме).

   5Результат оценивают по высоте приципитатавкапилляре.

             2Определение концентрации фибриногена

   Гравиметрический метод.К1 мл плазмы крови добавляют 0,05

мл суспензии тромбопластина (10 мг/мл) для быстрого  иполного

образования сгустка,0,1 мл 5% раствора хлорида кальция, пере-

мешивают. Через 7-15 минут инкубациипри375о0Собразовавшийся

сгусток отжималидо полного удаления сыворотки и взвешивали на

торсионных весах.Полученную величину умножали накоэффициент

0,222. Концентрацию выражали в г/л.

ш1. 1999г. ЗАПОЛНЯТЬ ТОЛЬКО В ЛЕКЦИИ ПО НЕСПЕЦ. ФАКТОРАМ

                      Содержание БОФ

─────────────────────┬───────────────┬─────────────────────────

                     │    В норме    │При остром воспалении

─────────────────────┼───────────────┼─────────────────────────

                     │               │

СРБ    (усл. ед.)    │70 нг/мл,т.е.│    0,1 г/л

                     │почти нет      │

   - у новорожденных │100 нг/мл с    │

                     │постепенным    │

                     │возрастанием   │

                     │               │

Фибриноген           │2-4 г/л        │

                     │3-4 г/л        │    6-10 г/л

Гаптоглобин (Нр)     │170-300мг/л    │

                     │(70-150 мг%);│

                     │830-2700мг/л   │

                     │0,1-0,04г%   │

                     │0,6-1,8 г/л    │    3-6 г/л

Преальбумин          │3007+020 мкг/мл│

Орозомукоид (Оm)     │550-1400 мг/л│

                     │= мкг/мл       │

                     │0,6-0,9 г/л    │  1,5-3 г/л

Антитромбин-III      │210-300 мг/л   │

С3-компонент         │550-1200 мг/л│

комплемента          │1,3-1,7 г/л    │  2-3 г/л /2809к/

                     │100 мг%        │

С1q-субкомпонент     │100%           │

комплемента          │               │

Трансферрин          │30307+0350 мкг/мл│

Церулоплазмин        │2607+030 мкг/мл│

                     │0,3-0,6 г/л    │  1-2 г/л

альфа-2-макроглобулин│21507+0150 мкг/мл│

                     │(500-2500 мг/л)│

альфа-1-антитрипсин│22018+0200 мкг/мл│

─────────────────────┼───────────────┼─────────────────────────

4альфа-1-антипротеаз- │2,5-4,0 г/л    │ 5-7 г/л

4ный ингибитор /???/│               │                -?

                          2Оценка ПОЛ

   2Определение активности каталазы0. Активность каталазы опреде-

ляли в гемолизатах крови на основе способности перекиси водоро-

да образовывать окрашенных комплекс с молибдатом аммония. Инку-

бационная смесь объемом 2 мл содержала 0,03% Н420О420. Реакцию ини-

циировали внесением 0,1 мл гемолизата в разведении 1:1000. Про-

должительность инкубации - 10 минут.Температура 25градусов.

Поокончании  инкубации приливали 1 мл 4%  молибдата аммония и

измеряли поглощение при длине волны 410 нм.Для расчета актив-

ности фермента использовали коэффициент мольной экстинции цвет-

ного комплекса Н420О420 и молибдата аммония - 10520М5-10см5-10.Актив-

ность каталазы выражали в ммолях Н420О420 с5-10л5-10.

   2Определение содержани МДА0. МДА определяли в цельной крови по

цветной реакции с ТБК (Бородин Е.А.,Арчаков А.И.,1987).К 1 мл

образца добавляли 1 мл 30%ТХУи  центрифугировалипри3000

об./мин.в  течение 10 минут.К надосадку приливали 1 мл 0,8%

ТБК и ставили на кипящую водяную баню на 15 минут. По окончанию

инкубации пробирки охлаждали, приливали 1 мл хлороформа и цент-

рифугировали при 3000 об./мин.в течение 5 минут дляудаления

мутости. Верхнюю окраенную фазу осторожно переносили в кювету и

измеряли светопоглощение при 532 нм. При расчете содержания МДА

впробе  использоваликоэффициент мольной экстинции 1,56х105-5

М5-10см5-10. Содержание МДА выражали в наномолях на 1 мл крови.

   2Определение диеновых конъюгатов0.0,1 мл спиртового раствора

липидов вноили в кювету спектрофотометра СФ-16, в которой нахо-

дились 2,9 мл абсолютного спирта. Оптическую плотность измеряли

при длине волны 233 нм с ходом луча 10 мм.Для перерасчета ис-

пользоваликоэффициетн  мольнойэкстинции2,2х105-50   М5-10см5-1

(СтальнаяИ.Д.,1977).  Величину диеновых конъюгатов выражали в

наномолях на 1 мл крови.

   2Определение гидроперекисей липидов0.Количество гидропереки-

сей липидов определяли на основе их способности  окислятьионы

Fe52+ 0cпоследующей реакцией на Fe53+0 с тиоцианатом аммония (Ро-

манова Л.А.,Стальная И.Д.,1977 вмодификации  Е.А.Бородина).

Для расчетасодержания гидроперекисей использовали коэффициент

мольной экстинции образующегося цветного комплекса Fe[Fe(CNS)]46

при 490нм  1,1х1055 0М5-10см5-10,а в расчете на ион Fe53+0 0,55х1055

М5-10см5-10 (Бородин Е.А.и соавт.,1992).Величину гидроперекисей

выражали в наномолях на мл крови.

   2Определение окисляемости сыворотки крови0. Окисляемость сыво-

ротки крови изучали по степени накопления МДА при индукции Fe52+

аскорбат-зависимого или НАДФН-зависимогоПОЛв  инкубационной

смеси объемом1мл,  содержащей 12 мкМ Fe52+0;  0,8 мМ аскорбат

(или 1 мМ НАДФН);0,2 мМ пирофосфат натрия; 50 мМ трис-НСl бу-

фер, рН 7,4;0,1 мл сыворотки крови и выражали в наномолях МДА

мин5-10мл5-10 сыворотки крови.

   2Определение антиокислительной0(антиоксидантной)2активности

2(АОА) крови0.АОА сыворотки крови оценивали в условиях in vitro

по ихспособности  тормозитьаскорбат (НАДФН)-зависимое ПОЛ в

суспензии микросом (М.А.Штарберг,1996) и выражали в  процентах.

Опытная инкубационнаясмесьобъемом 1 мл содержала 0,8 мМ ас-

корбат (или 1 мМНАДФН);0,2  мМпирофосфатнатрия;  50мМ

трис-НCl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида микросом, 0,1 мл сы-

воротки крови. ПОЛ инициировали внесением ионов5 0Fe52+0 в конечной

концентрации 12 мкМ.Контрольная проба аналогичного состава не

содержала сыворотки крови. АОА рассчитывали по формуле:

          МДА5 4контроль 0- МДА4 опыт

   АОА = ────────────────────────4─0 х 100%.

                МДА4 контроль

   2Определение токсигенной зернистости нейтрофилов0. Токсигенную

зернистость изучали с иммерсионной системой микроскопа в препа-

ратах крови,окрашенных по Паппенгейму,Нохту.  В сравнении с

нейтрофильной зернистостьюнормальныхлейкоцитов  она   более

крупная иинтенсивнее  окрашивается.Учет ведут суъектвино по

количеству гранул, их размерам и интенсивности окраски: (-) или

(+) (Ронин В.С., Старобинец Г.М.,1989).

   2Парамецийный тест0.

   Сущность методы оценки токсичности биологических жидкостей с

парамецийным тестом (Пафомова Г.А. и соавт. /1980/ с добавлени-

ем условийпо Нифантьеву О.Е.и соавт.  /1988/) заключается в

измерении времени жизнеспособности парамеций (инфузорий) - "па-

рамецийного времени" в присутствии токсического фактора,нахо-

дящегося в биологической жидкости.В качестве контроля опреде-

ляли времявыживаемости инфузорий в присутствии плазмы или сы-

воротки крови здоровых людей. 0,01 мл исследуемой биологической

жидкости и столько же взвеси,содержащей от 8 до 10 парамеций,

тщательно перемешивали и под увеличением объектива в 25 раз оп-

ределяли времяполной гибели парамеций.Образец исследовали 3

раза и использовали средние данные.С целью повышения точности

способа использовали 11-15-суточную культуру парамеций.

   _Проверка дефицита Se в организме.: кончики пальцев рук проте-

реть спиртом,затем 7,5% Н420О420. Если кожа побелеет, то дефицит.

/со слов проф. М.А.Джулай/

             2Определение бактерициднойактивности

                        2сыворотки (БАС)

         (= комплемент, + лизоцим, + катионные белки)

   В пробирки  с2,5 мл стерильного бульона Кольбака добавляют

по 0,5мл испытуемой сыворотки.Затем микропипеткой во все про-

биркивносятпо  0,1мл 24-часовой бульонной культуры кишечной

палочки.Содержимое пробирок тщательно перемешивают и отбирают

1,5млдля нефелометрического измерения оптической плотности.

Смесь, оставшуюся в пробирках, помещают в термостат при 37500С на

3часа.  (Расчет бактерицидной активности в процентах произво-

дится по ниже описанной формуле.) Таким образом,  удается снять

2показателя:  первый-характеризующийисходную оптическую

плотность бульона с культурой и сывороткой сразу  послесмеше-

ния, и второй - регистрирующий оптическую плотность той же сме-

си после 3-часовой инкубации смеси в термостате.

   (Д опыта через 3 часа - Д опыта сразу) х 100

   ───────────────────────────────────────────── =

   (Д контроля через 3 часа - Д контроля сразу)

     (0,18 -0,163) х 100

   = ──────────────────── = 7,8%

        0,312 - 0,095

2Биологический метод - парамецийный тест

   Сущность метода заключается в измерении времени жизнеспособ-

ности парамеций (инфузорий) -"парамецийного времени" в присутс-

твии токсического фактора, находящегося в биологической жидкос-

ти. В качестве контроля определяют время выживаемости инфузорий

в присутствииплазмы или сыворотки крови здоровых людей.0,01

мл исследуемой биологической жидкости и столько же взвеси,  со-

держащей от8  до10 парамеций,тщательно перемешивают и под

увеличением объектива в 25 раз определяют время  полнойгибели

парамеций.Образец исследуют3раза и расчитывают средние дан-

ные. С целью повышения точности способа используют 11-15 суточ-

ную культурупарамеций.  времяжизнеспособности парамеций при

добавлении к их культуре биологической жидкости здоровых  людей

составляет 25-30минут(106,137,47-ЛИИ - лейкоцитарный индекс

интоксикации)

      2Определение содержания МСМ в сыворотке крови, лимфе

                           (молекулы средней массы)

   Принцип методаоснован на осаждении белков исследуемой жид-

кости 10%р-ром ТХУ с последующим центрифугированием при3000

об/мин в течении20 мин. и определением поглощения супернатанта,

в 10 раз разведенного дистиллированной водой,  (при длине волны

280 нм)против воды.  Сдержание МСМ выражают в условных едини-

цах, соответствующих величине оптической плотности разведенного

супернатанта. Внорме  количество МСМ составляет 0,260,280 ус-

ловных единиц (24, 102)

         2Определение общей протеолитической активности0

   В кювету спектрофотометра вносили 0,03 мл цельнойсыворотки

крови, 1,97 мл 0,05М трис НС1 буфера и 1,0 мл 1,5*10 5-30М БАЭЭ в

этом буфере,перемешивали. Оптическую плотность измеряли в те-

чении 30 мин. через каждые 10 мин при длине волны 253 нм против

раствора не содержащего сыворотку крови.  Протеолитическуюак-

тивность выражали в МЕ/мл. (100)

                 2Оценка активности катепсина D0

   Определение количества кислоторастворимых продуктов фермент-

ного гидрролиза гемоглобина (6).Инкубационная смесь содержала

0,5 мл сыворотки крови,0,5 мл 0,2М ацетатного буфера и 0,2 мл

0,3% раствора гемоглобина в ацетатном буфере. Продолжительность

инкубации60 мин. t=45500 С. По окончании инкубации приливали 4 мл

3% ТХУ(трихлоруксуснаякислота),  замерялипридлине волны

280нм. Содержание катепсина Д выражается в условных единицах.

        2Определение содержания альфа-1-АТ и альфа-2-МГ

   Способ определенияальфа-1-АТ  и альфа-2-МГ в плазме (сыво-

ротке) крови основан на различном механизме взаимодействия их с

трипсином при использовании в качестве субстрата БАЭЭ (N-бензо-

ил-L-аргинин этиловый спирт)1.Альфа-1-АТ образует стрипсином

комплекс,неспособный гидролизовать комплекс БАЭЭ. Поэтому его

активность оценивается по торможению БАЭЭ-эстеразной активности

трипсина сывороткой крови.

   В кюветах  спектрофотометраготовиликонтрольную и опытную

пробы. Опытная проба содержала 1,9 мл 0,005 М трис  НС1буфера

(рн 8,0),0,1 мл разведенной в 50 раз сыворотки крови и 0,1 мл

0,1% раствора трипсина. Контрольная проба содержала 2 мл 0,05 М

трис НС1 буфера (рн8,0) и 0,1мл 0,1% раствора трипсина. Инкуби-

ровали при t=25500 5 мин и добавлялти по 1 мл 1,5мМ раствораБА-

ЭЭ. Быстро перемешивали и измеряли прирост оптической плотности

растворов при длине волны 253 нм против контроля.Отсчеты  произ-

водили каждуюминутув течении 5 мин.При расчете активности

фермента использовали разность средних значений прироста актив-

ности за 1 мин. Активность альфа-1-АТ выражается в ИЕ/мл.

   Альфа-2-МГ образует с трипсином комплекс,сохраняющийспо-

собность кгидролизу  БАЭЭссывороткой  крови и последующей

инактивацией несвязавшегося с альфа-2-МГ трипсина соевым  инги-

битором трипсина (86). В кювету спектрофотометра вносили 1,75мл

0,05М трис НС1 буфера,рн 8,0, 0,1 мл разведенной в 10 раз сы-

воротки кровии 0,05МЛ 0,1%раствора трипсина .Инкубировали 5

мин при t=25500С, добавляли0,1 мл 0,3% раствора ингибитора из бо-

бов сои,перемешивали и инкубировали 5 мин.Затем добавляли 1

мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ,пробу перемешивали и измеряли прирост

оптической плотности при длине волны 253 нм через 2 мин в тече-

нии 10 мин против контрольной пробы, содержащей только реактивы

(2мл 0,05М трис НС1 буфера, рн8,0 и 1 мл 1,5мМ раствора БАЭЭ)

расчета активности фермента использовали среднее значениепри-

роста оптической плотности за 1 мин.Активность альфа-2-МГ вы-

ражали в ИЕ/мл сыворотки крови.

                3Оценка фагоцитарной активности0

                  5(+ см. материал 1-2 лекции)

   1Фагоцитарный индекс0 - среднее количество частиц или микробов

                         в одном фагоците (норма 3-8).

   1Фагоцитарное 0ч1исло0- количество фагоцитов, участвующих в фа-

                         гоцитозе (норма 60-80%).

   5Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет

5оценить динамику фагоцитоза.В норме через 90 минут фагоцитар-

5ный индекс должен быть ниже, чем через 45 и 60 минут, в связи в

5перевариванием микробов.При нарушении переваривания он не ме-

5няется. /2551к/

   _Переваривание микробов. можно оценивать путем посевализатов

лейкоцитов напитательныесреды  и подсчета выросших колоний.

Метод предполагает использование в качестве объекта  фагоцитоза

живых микроорганизмов. После инкубирования с микробами фагоциты

осаждают центрифугированием,омывают и лизируют. Их лизаты вы-

севают на твердую питательную среду.Переваривающую активность

фагоцитов оценивают по числу выросших колоний. /2551к/

   _Метаболическую активность фагоцитов. определяют после окраски

их 0,25%раствором нитросинего тетразолия.В норме метахрома-

тично (диффузноиввиде глыбок голубого цвета) окрашивается

15-18% нейтрофилов, при инфекциях их число увеличивается до 40%

и более. /2551к/

   Показатели фагоцитоза снижаются при иммунодефицитах, повыша-

ютсяпри благоприятном течении инфекции. /2551к/

               2Оценка комплементарной активности

   1) 3Общаягемолитическаяактивность комплемента0 должна быть

                         100_+.20% от уровня здоровых доноров.

   Степень гемолизаможно определить фотометрически (с помощью

нефелометра, спектрофотометра,фотоколориметра) иливизуально

путем сравненияинтенсивностигемолиза в опытных пробирках со

стандартной шкалой лизированных эритроцитов. /2551к/

   2) Уровень отдельных компонентов4 можно оценить пореагентам

4(R)по  степени компенсации отсутствующего в них белка при до-

4бавлении сыворотки больных.(R1 - cыворотка с дефицитом компо-

4нента С1,0

4R2 - сыворотка с дефицитом компонента С2,

4R3 - - " - С3,

4R4 - - " - С4 и т.д.)

   _В сыворотке крови

   С1q - 190 мг/л,

   С1s - 120

   С2  -30

   С4- 430

   С3  -1300

   С5  -75

   С6  -60

   С7  -55

   С8  -60

   С9- 160

ф. Р  -25

ф. В- 240

С1-In- 180 мг/л. /2551к/

   3) Выявление отдельных продуктов активации - С5а (по степени

агрегации лейкоцитов), С4а, С3а, С3в, С2в-кининаи др.

   4) Определение комплемент-связывающих рецепторов на лейкоци-

тах (CR1, CR2, CR3). /2551к/

                      2ОБЩАЯ ИММУНОГРАММА0

             2┌─────── Специфическая защита ───────┐

             │                                    │

        Гуморальная                           Клеточная

        - АТ                                  - Тк

   5Различают следующие степени иммунитета:

   51. полная восприимчивость инфекции (100% гибель);

   52. Слабый иммунитет;

   53. умеренный иммунитет;

   54. сильный иммунитет (летальных случаев нет);

   55. полный иммунитет (абсолютная резистентность)./261/66/

   5Широкая вариабельность показателей иммунитета,изменчивость

5в течение года не всегда позволяет полно оценить картину систе-

5мы иммунитета. /1677к/

   5Вторичный ИО на экзогенные АГ не отражает состояния иммунной

5системы. Для оценки иммунного статуса необходима  информацияо

5первичных гуморальных   или   клеточных  реакцияхнаантиген.

5/7576/84/

                    2НОРМАЛЬНАЯ ИММУНОГРАММА

   2Общее количество лейкоцитов - 4-90 2тыс./мкл

   5Подсчет в камере Горяева (25 больших квадратов)

          5N х 4000 х 20 (разведение)         N х 1000

   5L = ────────────────────────────────= ─────────── = N х 200

                  525 х 16                       5

   N должно быть от 20 (4 тыс.) до 40 (8 тыс.).

   2Лейкоцитарная формула:0   Размер

   Нейтрофилов - 50-60%     10-12 мк

   Эозинофилов - 3-5        12-17 мк

   Базофилов - 0,5-1        10-12 мк

   Моноцитов - 5-8          12-15 мк (тканевые - больше)

   Лимфоцитов - 25-35%      7-8 мк малые; около 12 мк - большие

                            (тканевые лимфоциты - еще больше)

                            Эритроциты - 7_+.0,5 мк

                            Тромбоциты - 2(-4) мк

     [5ПОЛ на стекле --- лимфоцитоз0]

   5Лимфоцитов от 25% (т.е. от 1000 до 2250 мкл-1)

              5до 35% (т.е. от 1200 до 3000 мкл-1).

   5Подсчет абсолютного количества лимфоцитов у больного:

   5Например, общее количество лейкоцитов - 5 тыс/мкл,

             5количество лимфоцитов в лейкоцитарной формуле - 20%

             5(=относительное количество лимфоцитов);

             5Абсолютное количество - 20% от 5 тыс, т.е. 1 тысяча

             5в 1 мкл. Вывод: меньше нормы.

Количество лимфоцитов - 1800-3200 мкл5-10, (800-3600 в мкл);

                      - 25-35%(20-26%  /2551к/) всех лейкоци-

                        тов.

_В крови В-лимфоцитов - 15%./2338к/94/ (15-25%);CD19+, CD22+,

                       CD725+0-клетки - 10-15% (В-клетки);

                       (CD72+ -клетки - 30-35%) - ???

        _Т-лимфоцитов - 60%., из них Тх - 20%1 0(CD45+0-клетки-36-42%)

                                   Тs - 12% (CD85+0-клетки-28-35%

                                        = Тs + Тк)

                       CD35+0-клетки - 55-70% (общие Т-лимфоциты)

        _О-лимфоцитов - 25%. /2338к/94/, (10%)

_Т-лимфоциты.:

- CD 3 - 600-2500 (1000-1400) мкл5-10 (в среднем 1400);

- в тесте розеткообразующих клеток(Е-РОК)  Т4общие0(=То)-

    50-60 (50-70%, 40-90)% от общего количества лимфоцитов;

- CD2+, CD3+ - 70-85% /2551к/98/

- Та-лимфоциты (Т4активные0=Та) - 700-1100 мкл5-10 или 25-35%;

    Для выявления активированных Т-лимфоцитов определяют рецеп-

    тор  кИЛ-2 (CD25),HLA DR-антигены и CD 71 (рецептор для

    трансферрина).

_Тх-лимфоциты. (CD4+) - 700-1100 мкл5-10 (930);

- Теофиллин-резистентные Е-РОК(Тх)- 50-63%.

- CD4+ - 35-48% /2551к/98/

    При снижении Тх до 200 - СПИД прогрессирует;

    < 150 - присоединение вторичной инфекции (сепсис).

_Тs-лимфоциты. (CD 8+) - 300-500 мкл5-10 (500);

   - CD8+ - 18-25%/2551к/98/

   = Теофиллин-чувствительные Е-РОК(Тs)- 17-20%

Соотношение Тх/Тs (= CD4+/CD8+) - 2,0-2,5 (1,5-2,5$ 1,4-2,0);

   - При СПИДе соотношение уменьшается до 0,04.

   - При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс боль-

     ше 2,0. /2551к/98/

_В-лимфоциты. (CD 19,CD22, CD72)- 350-500 (100-900;600-800) мкл5-1

или 15-25 (10-30)% /?/(в тесте В-РОК=ЕАС-РОК)

_Иммуноглобулины сыворотки крови

- Ig M-  1-2(0,35-3; 0,2-2) г/л или мг/мл

- Ig G- 11-15 (8-13, до 20 - у пожилых лиц) г/л или мг/мл

- Ig A-  1-3(0,4-4,4; 1,4-3) г/л или мг/мл

У новорожденных уровень Ig G близок к материнскому, Ig M и Ig

A имеютсяв следовых концентрациях.К 4-6 месяцу уровень Ig G

падает до 5-6 г/л, а затем увеличивается. При нормальном разви-

тии уровень иммуноглобулинов к 2 годам у детей близок величинам

их у взрослых. /2551к/98/

- 4Разброс значений Ig E (0-386 кЕ/л) не позволяет рекомендовать

4этот тест для диагностики атопии. /1676к/

   При иммунодефицитах (ИД) уровень Ig снижается,а при стиму-

ляции ИС и воспалении - повышается. /2551к/

                Иммуноглобулины сыворотки крови

────────┬───────┬────────┬────────────────┬─────────┬──────────

Классы│ МЕ/мл │мг/мл │     мг%        │   г/л   │В слюне

────────┼───────┼────────┼────────────────┼─────────┼──────────

Ig G    │130-160│11-15 │ 1800-1800 (1200)0│12,87+00,54│0,067+00,01

- Ig G1 │       │        │                │2,61-10,8│г/л

- Ig G2 │       │        │                │1,12-4,08│

- Ig G3 │       │        │                │0,22-2,88│

- Ig G4 │       │        │                │0,05-1,56│

Ig M    │110-150│ 0,5-2,0│ 1 60-200(120)0 │ 1,37+00,1 │0 г/л

Ig A    │ 90-150│   1-3  │ 1 90-450  (400)0 │ 1,67+00,7 │0,03-0,4

        │       │        │                │         │г/л

        │       │        │                │         │= sIg A

1Ig E    0│1       0│1        0│10,006-0,6(<0,5)0 │         │

75,97+09,3 КИ/л   │        │                │         │

1Ig D    0│130,96+14,0        0│1 0,3-40     (3)0 │         │

        │1 МЕ/л-?│0        │                │         │

────────┴───────┴────────┴────────────────┴─────────┴──────────

              Иммуноглобулины слюны /1652к и др./

───────────────────────────────────────────────────────────────

   Классы  │ МЕ/мл │мг/мл │     мг%        │   г/л   │ КИ/л

───────────────────────────────────────────────────────────────

   Ig G    │                                 │0,067+00,01│

   Ig M    │                                 │0        │

   Ig A    │                                 │0,077+00,01│

sIg A    │                                 │0,727+00,05│

───────────────────────────────────────────────────────────────

   Определение уровняиммуноглобулинов не всегда полезно.Для

иммунной защиты имеет значение количество  специфическиханти-

тел, а не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки.

       Антитоксические и антимикробные антитела /1652к/

───────────────────┬─────────────────┬─────────────────────────

   Виды антител    │    по РПГА      │         по РА

───────────────────┼─────────────────┼─────────────────────────

   Дизентерийные   │                 │       3,87+00,5

   - Зонне         │   21,27+03,2    │

   Коклюшные       │  716,27+0105,2    │      90,27+0 64,4

   Дифтерийные     │  362,97+0105,7    │     43,07+0 16,1

   Стафилококковые │969,77+0210,3    │     238,67+0128,7

   Столбнячные     │ 1823,57+0211,1    │      55,77+0 32,2

───────────────────┴─────────────────┴─────────────────────────

   Будущее покажет, что конкретные числовые значения малоинфор-

мативны и подобный подход к оценке иммунного  статусаневерен.

Нормальноеколичество В-лимфоцитов может обеспечиваться совер-

шенно разными сочетаниями АГ-специализированных  клеток.Повы-

шенное количество Тх еще ничего не значит, если не хватает мак-

рофагов и т.д.Наоборот,малое число Тх может быть идеальным,

если снижены Тs. /2338к-5/ Иммунная система имеет территориаль-

ные особенности, поэтому показатели кровотока могут не отражать

процессы, происходящие в конкретном больном органе.  5Для ИС ха-

5рактерна высокая мобильность, связанная с тем, что все ее глав-

5ныекомпоненты практически всегда находятся (или рабочем) сос-

5тоянии и определенныйуровеньактивации,  вероятно,является

5нормальным состоянием ИС.В 1987г. Р.В.Петровым сформулирована

5концепция иммунологических мобилей, сущность которой заключает-

5ся в том,что под влиянием АГ-ых и неАГ-ых воздействий, непре-

5рывно поступающих во внутреннюю среду организма или в немвоз-

5никающих, ИС  постоянноменяетсвой облик,  постоянно меняет

5уровни своих составных частей (Тх,Тs, контрсупрессоров и т.д.).

5Поступивший в организм АГ-ый стимул выводит из равновесия прак-

5тически всю ИС, и она будет "возмущена" до тех пор, пока не пе-

5рейдет в новое равновесное состояние. Это состояние сохраняется

5лишь до тех пор, пока другой стимул не поступит или не возника-

5ет в организме.А так как антигенные стимулы поступают в орга-

5низм непрерывно,то очевидно, что ИС непрерывно меняется и на-

5ходится в движении. В свете концепции иммунологических мобилей,

5а также на многоступенчатом уровнерегуляциииммунологических

5процессовпо-новому встает вопрос о нормативных параметрах ИС.

5/2338к/94/0 В свете этих особенностей функционирования иммуните-

та возможны такие ситуации, когда развиваются изменения или на-

рушения в ИС,которые практически никогда не ведут к возникно-

вению иммунопатологических процессов, так как другие компоненты

этой системы берут на себя функции нарушенной структуры. Приме-

ромявляются  случаи селективного дефицита Ig A при полном от-

сутствии каких-либо иммунопатологических проявлений. /2338к/94/

С другой стороны, возможно наличие патологического процесса без

видимых нарушений в иммунной системе. /2338к/94/

   5В 1987г.американский иммунолог R.Hong разработал трехэтап-

5ную системуоценкиИС.0  5Р.В.Петровым создан 2-этапный принцип

5оценки иммунного статуса.0

   _Выделяют 3 уровня иммунологических тестов.:

   31. Первыйуровень.0Первый  этап предназначен для выявления

"грубых" дефектов иммунитета с помощью ориентировочных  тестов.

   - Определение лейкоцитарной формулы и общего количества лей-

коцитов в периферической крови.

   - Подсчет  относительногоиабсолютного  количестваТ-и

     В-лимфоцитов.

   - Определение уровня иммуноглобулинов и их субклассов. Изме-

рение концентрации Ig G, Ig M, Ig A (дефицит Ig A может не соп-

ровождаться патологией. /2338к/94/)

   - Оценка специфического гуморального ответа(иммунизацияс

последующим определением уровня АТ).

   - Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов.

   - Определение активности системы комплемента.

   - Кожные тесты.

   - Определение морфологиии лимфоцитов.

   - Рентгенографияи рентгеноскопия лимфоидных органов.

   32. Второйуровень.0/6812/84/ Тесты 2 уровня обозначают как

аналитические.К ним могут относиться практическивсе  тесты,

позволяющие оценить функциональную активность клеток.

   - Определение уровня цитокинов (фактора,ингибирующего миг-

рацию макрофагов /МИФ/,интерлейкинов,ФНО и др.) в крови и в

других биологических жидкостях.

   - Анализ  поверхностныхмаркеровсубпопуляций   лимфоцитов

     (CD-АГ)

     -- субпопуляций Т-лимфоцитов (хелперы,супрессоры, эффек-

        торы);

     -- опредениеповерхностных   иммуноглобулинов   различных

        классов на В-лимфоцитах;

     -- количественное определение ЕКК.

   - Оценка  развития клеточного и гуморального иммунного отве-

     та.

   - Определение функциональнойактивности  клеток ИС

     -- анализ пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на

Т- и В-митогены и специфические антигены(реакциябласттранс-

формации на митогены: ФГА, Кон А, ЛПС, митоген лаконоса; на ми-

тогены в СКЛ),

     -- оценка функциональной активности В-клеток (фенотип, по-

ликлональная активация,продукция иммуноглобулинов вкультуре

in vitro, антиген-специфическая стимуляция, иммунизация убитыми

вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ 174),

     -- анализ цитотоксичности (NK-клетки, Т-киллеры).

        --- определение активности ЕКК;

        --- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип,

поликлональнаяактивация  митогенами,антигенамив смешанной

культуре лимфоцитов /СКЛ/,тесты Т-хелперной иТ-супрессорной

активности, антиген-специфический ответ, цитотоксическая актив-

ность,кожные тесты ГЗТ на туберкулин, стрептокиназу, кандидин

и пр.);

     -- оценка  функциональной активности макрофагов (адгезии и

хемотаксиса,стадий фагоцитоза и его завершенности, внутрикле-

точнойинактивация  Staphylococcus aureus,тест кожного окна,

хемилюминесценции).

   - Количественное определение отдельныхкомпонентов  компле-

     мента (субкомпонента С1q, С3, С6-С8).

   - Оценка  миграционнойактивностилейкоцитов  (макрофагов,

нейтрофилов, лимфоцитов). Анализ молекул адгезии.

     -- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА.

   5- Оценка HLA.

   33. Третий уровень.

   - Генетический и цитологический анализ хромосомного материа-

ла.

   - Определение ферментов лимфоцитов (аденозиндезаминаза,пи-

риннуклеозидфосфорилаза), ассоциированных с иммунодефицитами.

   - Анализ смешанных клеточных культур с целью определения им-

муноглобулин-продуцирующей функции В-лимфоцитов.

   - Гистохимический анализ лимфоидных органов.

    Хорошо диагносцируются первичные (врожденные) иммунодефици-

ты, вторичные четко регистрируются при хронических патологичес-

ких состояниях.

   В настоящее  время нет достаточно универсального набора тес-

тов для оценки первичных и вторичных иммунодефицитов. /6812/84/

   Определение уровняиммуноглобулинов не всегда полезно.Для

иммунной защиты имеет значение количество  специфическиханти-

тел, а не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки.

───────────────────────────────────────────────────────────────

              3РАЗДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

(для изучения функциональной активности,

                      определения HLA-АГ)

   Принципы разделения:

По различным   адгезивным   способностям  (АГ-предентирующие

клетки - моноциты и В-лимфоциты адгезируют к твердым поверхнос-

тям):

   - к стеклу (стеклянным бусам),клетки отделяют отсорбента

встряхиванием),

   - найлоновая вата в шприце (В-лимфоциты снимают5-6-кратным

сдавлением ваты поршнем шприца)

   - сефадекс.

   2Аффинная хроматография0основана  наизбирательнойсорбции

клеток различных субпопуляций к носителю, содержащему вещества,

ккоторым  клеткиданнойсубпопуляции имеют высокое сродство

(АГ, мембранные Ig,через "пришитые" FcR,белок А стафилокок-

ков, CR1).

   - 4Желатин смешивают с АГ,покрывают центрифужные пробирки +

4суспензиюлимфоцитов.  С АГ связываются АОК --- нагрев до 37оС

4выход АОК.0

   4- Эритроцитынагружают  белкомАстафилококка + суспензия

4лимфоцитов --- связывание зрелых В-лимфоцитов. Элюция гипотони-

4ческим раствором или лизостафином.

   4- Монослой эритроцитов,нагруженных ИК + суспензия лимфоци-

4тов. Свободные В-лимфоциты получают гипотоническим шоком.

   4- Через CR1 В-лимфоцитов(на сефарозе-С3)

   - Аффинная  хроматографиянаколонках с лектинами;элюция

раствором углевода,по отношению к которому лектинспецифичен

(отделение агглютинированных клеток центрифугированием). Связы-

вание лектина Helix pomatia Т-лимфоцитаминаколонке  (лектин

связывает обработанные нейраминидазой Т-лимфоциты); Клетки элю-

ируют N-ацетил-D-галактозамином.

   Очищенные Т-лимфоциты можно получить путем отрицательной се-

лекции HLA-DR положительных клеток (т.е.  В-лимфоцитов), разру-

шая их соответственно антисывороткой и комплементом.

          Распределение Т- и В-лимфоцитов в организме

                      и их характеристика

──────────────────────┬───────────────────┬────────────────────

   Показатель         │    Т-лимфоциты    │    В-лимфоциты

──────────────────────┼───────────────────┼────────────────────

Источник              │Костный мозг       │Костный мозг

Место формирования    │Тимус              │Красный костный мозг

                      │                   │Группы    лимфоидных

                      │                   │фолликулов

1Распределение0, %1:0     │                   │

Красный костный мозг│      0│      15

Тимус                 │    100 (тимоциты) │       0 (0,3)

ЛУ                    │     60 (65)       │      20 (21)

Пейеровы бляшки       │     30│      60

Селезенка             │     30 (35)       │      60 (42)

Кровь                 │     60│      20 (15)

Лимфа                 │     85│      15

                      │                   │

Наличие АГ│ CD4+,CD8+         │     CD19+ и др.

                      │                   │

HLA                   │ Iкласса         │     I и II классов

─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ │ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ │ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─

Локализация           │                   │

- в ЛУ                │Паракортикальная   │Центры размножения

                      │зона,              │(зародышевые центры),

                      │перифолликулярное  │медуллярные тяжи

                      │пространство       │

- в селезенке         │Белая пульпа, окру-│Красная пульпа,

                      │жающая артериолы   │центры размножения

- в пейеровых         │Перифолликулярная│Центр фолликула

бляшках               │зона               │

Рециркуляция          │                   │

в организме           │Быстрая│Менее быстрая

Продолжительность     │                   │

жизни                 │Месяцы             │Недели

                      │                   │

Поверхность           │Гладкая│Ворсинчатая

                      │                   │

2Рецепторы к ЭБ0 (Е-РОК)│                   │

(эритроцитам барана=Е)│         +         │          -

2Рецепторы к С3в0       │                   │

(ЕАС-РОК)             │         -         │          +

2FcR                   0│2         -         0│2          +

Стимуляция синтеза ДНК│                   │

- митогены микробного происхождения       │

   - ЛПС Г- бактерий│         -         │          +

   - туберкулин       │         - /?/     │          + /2551к/98/

- митогены животного происхождения        │

   - анти-Ig          │         -         │          +

   - смешанная культура                   │

     лимфоцитов (СКЛ) │         -         │      + (АПК на HLA)

- митогены растительного происхождения (лектины)

   - ФГА              │     +(для Тs)     │          -

   - Кон А│     +(для Тs)     │          -

   _- митоген лаконоса .│_         +         .│_          +

   5- джекалин         0│5         +         0│5 связывает Ig A

                      │                   │ 5(используется для

                      │                   │ 5выделения В-клеток

                      │                   │ 5на колонке)

Связывание лектина    │                   │

Helix pomatia         │         +         │          -

                      │                   │

Чувствительность      │                   │

к кортикостероидам    │Высокая│Низкая (Л4960)

                      │                   │

Функции               1.Участие в реакциях│1.АТ--образование

                      │ клеточного типа   │2.Регуляция ИО

                      │ (Тк)              │(В-лимфоциты- АПК

                      2.Иммунорегуляторная│= АГ-презентирую-

                      │ (Тх, Тs)          │щие клетки)

──────────────────────┴───────────────────┴────────────────────

   3а. Д-лимфоциты-  двойные лимфоциты,несущие на своей по-

                       верхности маркеры Т- и В-лимфоцитов.

              ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

(количественный аспект; без разделения)

5I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

               5МЕТОДОМ МЕМБРАНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ /метод МИФ/

   Анализ поверхностных маркеров субпопуляций лимфоцитов,

(хелперы, супрессоры, эффекторы).

1ЕКК (CD3-_CD56+.),

В-клетки (СD19+)

Т-лимфоциты (_2СD3+.0,CD56-)1 - Образует комплекс с рецептором для АГ.

Тх - CD4+

Ts,Tk - CD8+.

   Выделение лимфоцитов на фиколе --- мазок --- высушивание ---

фиксация --- обработка МАТ к определенному АГ --- обработка ан-

тисывороткой кМАТ (к Fc-фрагменту),меченых флюорохромом ---

микроскопия под люминисцентным микроскопом.

   (Или в пробирке смешать суспензию лимфоцитов с МАТ --- мазок)

       _Определение субпопуляции лимфоцитов с помощью МАТ

    (моноклональных антител) методом непрямой поверхностной

                      иммунофлуоресценции

   Для постановки этой реакции в центрифужную стеклянную пробир-

ку вносят500  тысячлимфоцитов,выделенных  вградиенте фи-

колл-верографин. К 30 мкл суспензии клеток добавляют 20 мкл  го-

тового коммерческого раствора МАТ,осторожно перемешивали и ин-

кубировали в течение 30 минут при комнатной  температуре.После

инкубации к лимфоцитам добавляли 1 мл раствора Хенкса, перемеши-

вали легким покачиванием пробирки и центрифугировали 2 - 3 мину-

ты при 1200 об./мин.Надосадочную жидкость осторожно сливали, а

оставшиеся капли среды убирали фильтровальными полосками.

   В пробирку  к отмытым клеткам вносят 20 мкл вторых (антимыши-

ных) антител, меченных ФИТЦ (FITC anti Mi), нежно перемешивают и

помещают в рефрижератор при 45о0С на 30 минут.  После реакции лим-

фоциты дважды отмывают раствором Хенкса и к осадку клеток добав-

ляют 50 мкл того же раствора, клетки ресуспендируют легким пока-

чиванием пробирки.Суспензию клеток переносят в лунки парафилма

на сухое предметное стекло, предварительно обработанное в 0,005%

растворе poly-L-lysine (Sigma),и инкубируют там втечение20

мин при комнатной температуре. После адгезии клеток к стеклу ос-

торожно полосками фильтровальной бумаги убирали среду и  вносили

по 20 мкл 50%-го раствора глицерина.При люминесцентной микрос-

копии использовали объектив микроскопа х90,  окуляр х10.Оценку

реакции осуществляли по проценту светящихся клеток.

             Характеристика моноклональных антител

      в реакции непрямой поверхностной иммунофлуоресценции

──────────────┬5──────┬──────┬───────────────0┬──────────────────

Моноклональное│5Изотип│Клон│ Молекулярная0│ Специфичность

антитело    │5      │      │ масса антигена0│

──────────────┼5──────┼──────┼───────────────0┼───────────────────

DT-Anti-CD 3│5IgG 2a│ICO 90│ 26,20,16 кДа0│Зрелые Т-лимфоциты

              │5      │      │               0│

DT-Anti-CD 4│5IgG 1 │ICO 86│    56 кДа     0│Зрелые Т-хелперы/

              │5      │      │               0│ индукторы

              │5      │      │               0│

DT-Anti-CD 8│5IgG 1 │ICO 31│    32 кДа     0│Супрессорные/ цито-

              │5      │      │               0│токсические (киллер-

              │5      │      │               0│ные) лимфоциты

              │5      │      │               0│

DT-Anti-CD 16 │5IgG 1 │ICO116│   50-65 кДа   0│NK-клетки, грануло-

              │5      │      │               0│лоциты, макрофаги

              │5      │      │               0│

DT-Anti-CD 22 │5IgG M │ICO 91│    140 кДа    0│ В-лимфоциты

              │5      │      │               0│

──────────────┴5──────┴──────┴───────────────0┴─────────────────────

          5II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА

              5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

   Подсчитать относительное количество Т- и В-лифоцитов в гото-

вых мазках. Сделать заключение о наличии иммунодефицита.

              5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

   В крови - 60-80% Е-РОК,

   в лимфе - 95%,

   в ЛУ - 65-70%,

   в селезенке - 35-40%,

   в тимусе - более 95%.

   Данный тест - мера количества, а не функциональной активнос-

ти клеток. /6504/90-?/

   CD2 - рецептор для эритроцитов барана.При смешиваниисус-

пензии лимфоцитовсэритроцитами барана последние приливают к

ним, образуя т.н. "розетку". Процент розеток с эритроцитами ба-

рана /ЭБ/ по отношению к общему количеству лимфоцитов, оценива-

емое при проведении микроскопии,отражает относительноечисло

_Т-лимфоцитов (Т-РОК. = Т-розеткообразующая клетка).

   - Теофиллин-резистентные Е-РОК(Тх)- 50-63%.

   - Теофиллин-чувствительные Е-РОК(Тs)- 17-20%.

   Количество Т-лимфоцитов (Е-РОК)

   - в крови - 60 (80)%,

   - в лимфе - 95%,

   - в ЛУ - 65-70%,

   - в селезенке - 35-40%,

   - в тимусе - более 95%.

                 ┌───┐                 ┌───┐

             CD24─0┤6 0Т6 0├4─0CD2         FcR4─0┤6 0В6 0├4─0СR1

                 └───┘                 └───┘

   _Определение Т-лимфоцитов. осуществляли с помощью розеткообра-

зованияс эритроцитами барана (Е-РОК).С этой целью лимфоциты

человека, взвешенные в среде 199, в концентрации 2 х 10560 в 1 мл

предварительно инкубировали с исследуемыми образцами полипепти-

дов в различной конечной концентрации при температуре 37С в те-

чение 1 часа. После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добав-

ляли 0,1 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов барана, центрифугиро-

вали в течение 5 минут при 1000 об/мин. После центрифугирования

осадок ресуспендировали и подсчитывали процент "активного"ро-

зеткообразования Т-лимфоцитов с эритроцитами барана.Для опре-

деления общего числаТ-лимфоцитовлимфоцитарно-эритроцитарную

взвесь оставляли при температуре 45о0С в течение 2-х часов,после

чего подсчитывали в камереГоряевапроцент  розеткообразующих

клеток.

   - Теофиллин-резистентные Е-РОК(Тх)- 50-63%.

   - Теофиллин-чувствительные Е-РОК(Тs)- 17-20%.

     _Определение В-лимфоцитов.осуществляли с помощью розетко-

образования сэритроцитами барана,обработанными антителами и

комплементом.В этом случае также лимфоциты человека, взвешен-

ныев среде 199,  в концентрации 2 х 10560 в 1 мл предварительно

инкубировали с исследуемыми образцами полипептидов в  различной

конечной концентрациипритемпературе  375о0С в течение 1 часа.

После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,1 мл  1%

взвесиотмытых  эритроцитов барана,обработанных антителами и

комплементом,центрифугироваливтечение5  минутпри   1000

об/мин.После центрифугирования и повторной инкубации при тем-

пературе 375о0С в течение 30 мин.  осадок ресуспендировали и подс-

читывали процент розеткообразующих клеток.

   Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах,Т-лимфоцитах (в перифе-

рической крови - 60-79%Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

Т-лимфоциты практически все без исключения  связываютсясЭБ,

и в меньшй степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки и

кролика. При 455о0 происходит обратимая утрата  рецепторовкЭБ

Оптимальная температура- 4-185о0С (При 375о0 число розеток снижа-

ется до 20%). /6504/90-?/

   _В-лимфоциты., имеющие FcR и рецепторы к С3-компоненту компле-

мента (CR1), образуют розетки с эритроцитами барана, обработан-

ными антителами к ним и сывороткой мыши (как источника  компле-

мента). Также подсчитывается процент РОКпоотношению  к100

лимфоцитам (_В-РОК.).

   В крови В-лимфоцитов - 15% (10-25%).

   5Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах,Т-лимфоцитах (в перифе-

5рической крови - 60-79%Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

5Т-лимфоциты практически все без исключения  связываютсясЭБ,

5и в меньшей степени с эритроцитами козы,  крысы, морской свинки

5и кролика.При 45о происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ

5Оптимальная температура - 4-18оС (При 37о число розеток  снижа-

5ется до 20%). /6504/90-?/0

             5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

                    5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

   Определение активности лимфоцитов - реакция БТЛ вответна

митоген лаконоса. (функциональный аспект)

   Др. функциональные тесты (экспрессия рецепторов к определен-

ным регуляторам и пр.)

               2Определение HLA (по В-лимфоцитам0,

имеющим и I, и II класс антигенов HLA2)

   К суспензии  лимфоцитовдобавляют в 100 лунках по трафарету

МАТ к определенному HLA.В 6-12 лунках из 100 происходит обра-

зование ИК, которые выявляют последующим добавлением комплемен-

та (ксеногенной сыворотки).Под микроскопом определяют лунки с

разрушенными лимфоцитами.Если лимфоциты целы, то данного АГ у

человека нет.

   5[Из фракции лимфоцитов выделяется В-субпопуляция на нейлоно-

5вой вате;срывается с нейлона.HLA определяется по В-лимфоци-

5там, т.к. на них имеется HLA и I, и II классов.]0

   4Из гепариновой крови человека выделяют лимфоциты (аналогично

4методике определения РОК),раскапывают по 1 мкл в примерно 100

4лунок планшетки.Вкаждую лунку добавляют МАТ (1 мкл) к соот-

4ветствующему АГ и 1 мкл кроличьего комплемента  (цельнуюсыво-

4ротку). 1 час. 37о. Добавляют эозин, формалин. Планшетку ставят

4под микроскоп и определяют лунки с деструктированнымилимфоци-

4тами, т.е. с АГ человека. Если в данную лунку добавлялись МАТ к

4А8 и у человека имеется HLA А8,то антитела связываются с лим-

4фоцитом, т.е. образуется ИК, который активирует систему компле-

4мента и МАК разрушает лимфоцит.

                3ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

   - Подсчет относительного и абсолютного _количества. В-лимфоци-

     тов.

   - Развитие гуморального _иммунного ответа

     -- после иммунизации АГ-ом.

   - Определение функциональной _активности. В-клеток:

     -- фенотип,

     -- поликлональная активация - пролиферациямононуклеарных

        клеток  вкультуре клеток на среде 199 (реакция бласт-

        трансформации на митогены: ЛПС, на митогены в СКЛ),

     -- антиген-специфическаястимуляция  (иммунизация убитыми

        вирусными вакцинами,гемоцианином или бактериофагом ФХ

        174),

     -- продукция иммуноглобулинов в культуре in vitro,

     -- оценка  _миграционной активности. (с помощью миграция-ин-

        гибирующего фактора = МИФ).

   - Определениемедиаторов  гуморальногоиммунногоответа в

   крови и тканях (_уровень ИЛ-1,2,6,4.).

   - Оценка  функциональной_активности Т-регуляторов. (фенотип,

     поликлональная активация митогенами,тесты Т-хелпернойи

     Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ).

   - Определение поверхностных иммуноглобулинов различных клас-

     сов на В-лимфоцитах (МИФ и др.).

   - Общий уровень (нормальные,анамнестические АТ) иммуногло-

     булинов (_Ig М.G,A.);

     4-- ракетный электрофорез (ЭФ)

     4-- реакция преципитации (РП) по Манчини

     4-- РПГА.

     -- Уровень специфических АТ

     --- определение титра АТ у больного к определенномуинфи-

         цирующему агенту   (прямая  иразвернутаяРА,  РСК):

         столбнячных,дифтерийных, стафилококковых, коклюшных,

         дизентерийных и др.антител.

   - Определениеморфологиии лимфоцитов (должны быть шерохова-

     тыми)

                МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ /259,2551к/

────────────────────────────────────┬─────────────────────────

              Методы                │Чувствительность методов

                                    │(выявляемое количество

                                    │антител,г/мл)

────────────────────────────────────┴─────────────────────────

РА (реакция агглютинации)                  105-60-105-7

   - сальмонелл                            105-6

   - пневмококков                          105-2

РГА (реакция прямой гемагглютинации)       105-4

РПГА (реакция пассивной гемагглютинации)   105-70- 105-9

   - Реакция Кумбса                        105-7

Реакция коагглютинации (РКОА)              105-80-105-9

РП (реакция преципитации)

   - в геле                                105-20-105-3

   - кольцепреципитация                    105-3

   - нефелометрия,турбидиметрия

   - колориметрия (с реактивом Фолина)

   - встречный иммуноэлектрофорез /ИЭФ/    105-60-105-7

Реакция иммунофлюоресценции (ИФМ)          105-7

РЭМА                                       105-9 0и менее

РИМ                                        105-9 0и менее

Иммуноблоттинг(вестерн-блот)             105-70-105-9

РСК (реакция связывания комплемента)       105-6

Реакция иммунного лизиса                   105-80-105-9

РН (реакция нейтрализации)                105-40-105-6

Реакции анафилаксии, кожная проба

нейтрализации токсина (in vivo)

──────────────────────────────────────────────────────────────

   4Выявлена негативнаякорреляция между Ig M и альфа-2-макрог-

4лобулином (r=-0,85)и   максимальная   позитивная   корреляция

4(r=0,87) между Ig M и , бета-2-гликопротеином и C3а-активатором

4и церулоплазмином.Максимальному уровню Ig G соответствовали и

4максимальные уровни других белков (комплемента,  С1-инактивато-

4ра,альфа-1-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и пр.), что да-

4ло основаниепредположитьналичие конституционных типов орга-

4низма по белково-синтетической функции.

                    2Способы получения антител

   2I. Иммунизация (in vivo)

    Иммунизация человека или животных с последующим получением

    - цельной сыворотки

    - гипериммунной сыворотки

    - гамма-фракции (гамма-глобулинов)

    Используют по жизненным показаниям.

   Недостатки антисывороток:

   Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни

концентрировали, содержит набор различных антител.  Поэтомуее

называют поликлональной. Лишь небольшая часть антител направле-

на против специфичных антигенных детерминант,а остальные реа-

гируют с самыми разными антигенами.Этим объясняются многочис-

ленные "перекрестные" положительные реакции, которые приводят к

ошибочным диагнозам.

   Еще один серьезный недостаток:для получения антител каждый

раз необходимозановоиммунизировать животных и очищать выде-

ленную сыворотку. Это стоит немалых денег.

   3Этапы получения антисывороток

   31. Иммунизация

   Один объем  антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта

Фрейнда и тщательноперемешивают.Полученную  эмульсиювводят

внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины,расположенных по 5 в ряд

на расстоянии 2 см по обе стороны отпозвоночника.Общая  доза

иммуногена равна 10-100 мкг на кролика.Иммунизируют 6 кроликов

массой по 2 кг.Через 8-10 недель проводят пробноекровопуска-

ние.При  удовлетворительном качестве антисыворотки последова-

тельно проводят до 3 кровопусканий, после чего кроликам дают от-

дохнутьв течение 1 месяца и затем делают следующие кровопуска-

ния.При неудовлетворительном качествеантисыворотки  проводят

вторичнуюиммунизацию,  используяполовинную дозу иммуногена в

неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизируют подкожно в складку кожи

на шее. Через 10 суток делают пробное кровопускание и определяют

качество антисыворотки.При неудовлетворительном качестве инди-

видуальнойантисыворотки иммунизируют новую группу кроликов или

животных другого вида. /6817/84/

   32. Адсорбция (очистка)0 и тестирование

   - высаливание (осаждение сульфатом натрия или сульфатомам-

     мония)

   - осаждение спиртом

   - аффинной хроматографией

   - обработкой полиэтиленгликолем

   - каприловой кислотой

   - выделение на белок А-сефарозе

   33. Фракционирование0

   2II. MAT (in vitro).

    Получение МАТ (гибридомная технология)

   а) В-лимфоциты+  вирус Эпштейна-Барра --- быстро перестают

синтезировать АТ

   б) В-лимфоциты + миеломная лимфоцитарная клетка --- гибридо-

ма (под действием ПЭГа).

   МАТ с запрограммированнойспецифичснотьювпервые  получили

аргентинец Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер  (G.Koh-

ler) /Nature.- 1975. - V.256. - P.495-497/, за что получили в

1978 году Нобелевскуюпремию.Они  рассчитывалииспользовать

гибридомы лишь для изучения генетики антител,а результат при-

вел к подлинному буму.

   В основу метода положен давно известный принцип гибридизации

(слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделе-

нием и культивированием необходимого гибридного клона. Для сли-

яния используют клетки двух видов.Первые - плазмоцитомы (опу-

холевые плазмоциты)излиний,  культивируемых в искусственных

условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интен-

сивно размножаются без всякого внешнего стимула.  Другие клетки

- иммунные лимфоциты.Они несут в себе способностьсинтезиро-

вать ивыделять  необходимыеантитела.Однако в пробирке эти

клетки существуют лишь несколько дней.

   Образовавшийся прислиянии  двухклетокгибрид  наследует

признаки обоих "родителей".

   Получение гибридом включает 6 основных этапов.

   1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам анти-

гена, против которого необходимо получать антитела.

   2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с егоже

опухолевыми клетками.Длясоединения клеток используют обычно

полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностиные мембраны  испо-

собствующий соединению клеток.

   3. Отбор гибридов.Клетки культивируют в среде,содержащей

гипоксантин. Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его

разрушающего, а лимфоциты - просто потому,что не умеютдолго

поддерживать свое существование вне организма.

   4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вы-

рабатывают антитела против антигена,  использованнного для имму-

низации. Антиген прикрепляют к какому-либо носителю,например, к

пластиковым шарикам или пленке.Такой иммобилизованный антиген

обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гибридо-

мы,а затем наносят меченые антитела против мышиных или крыси-

ных гибридомных антител (их метят радиоактивными,  флуоресцент-

ными или ферментными метками).Иными словами,проводят анализ

культуральнойжидкости на присутствие антител к искомому анти-

гену.Если гибридомы производят антитела, то они осядут на ан-

тигене,а к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антитела.

В результате метка соединится с антигеном на носителе и  зафик-

сируется.

   5. Клонирование.Для  этойцели несколько гибридных клеток

переносят на питательную среду таким образом,чтобы ониросли

на достаточномрасстоянии друг от друга.Через несколько дней

вокруг каждой образуется колония дочерних клеток.  Этоиесть

гибридома. Клеткиколонииснова  разводят и помещают на пита-

тельную среду,чтобы устроить новые колонии. Клонирование пов-

торяют 3-4 раза,после чего получается устойчивая и продуктив-

наялиния клеток.

   6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональ-

ных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в

искусственных условиях или непосредственно из животных,  приви-

тых гибридомными клетками (как и многие злокачественные  опухо-

ли, гибридому можно прививать).

   _Преимущества МАТ.:

   1. Главная  особенность МАТ - чрезвычайная моноспецифичность

(против одной антигенной детерминанты)иабсолютная  однород-

ность.

   2. Возможность многократного получения в течение длительного

времени (воспроизводимость).

   3. Неограниченное количество получаемых антител.

   3. По  специфичности и чувствительности МАТ достигают значе-

ний, предельных для живой природы. Отсюда возможность использо-

вания для анализа антигенов не высокой степени чистоты.

   К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ.

   МАТ предполагаетсяиспользовать в лечебных целях в качестве

целенаправленных носителей,в составкоторых  будутвключены

токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные пре-

параты. Такие конъюгаты можно использовать в химиотерапии  опу-

холей и при трансплантации органов и тканей (введением МАТ про-

тив ОКТ 4,8,11;через 13 суток вырабатывались АТ навведенные

МАТ)./6815,6816/

   _Недостатки МАТ.:

   1. Одна из проблем,связана с тем, что МАТ - продукты мыши-

ных гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получе-

ния человеческих МАТ.

   2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантойиотсутс-

твие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной мо-

лекуле антигена.5Недостаток МАТ - отсутствиепреципитационных

5свойств,в  связи с чем чаще всего в тестах используются смеси

5моноклональных антител.0

   3. Возможностьнепредсказуемыхпекрестных  реакций с поли-

функциональными антигенными детерминантами.

   4. Вследствие этого - низкий аффинитет МАТ.

          _Исследование влияния на антителообразование

   5Для изучении влияния фармакопрепаратов на первичныйиммунный

5ответ животным вводят вещество (допустим, кордиалин в физиологи-

5ческой дозе 0,15 мг/кг в течении 3недель3  разавнеделю).

5Контрольнаягруппа должна получать такое же количество физиоло-

5гического раствора.Допустим, на 14-е сутки, после первого вве-

5дения, животных иммунизируют эритроцитами барана в дозе 108 кле-

5ток на мышь (внутрибрюшинно). На 20-е сутки эксперимента в реак-

5цияхгемагглютинации и гемолиза можно определить титр гемагглю-

5тининов и гемолизинов.

   5В селезенке животных оценивают количество антителообразующих

5клеток (АОК) по методу A.Cunningham (1965),  сравнивая их коли-

5чество в опыте и контроле. Коэффициент стимуляции антителообра-

5зования в обеих серияхрассчитываютпо  отношениюколичества

5АОК, приходящихся на 106 ядросодержащих клеток в опыте, к соот-

5ветствующему количеству АОК в контроле.

5Литература: Зимин...  Лабораторное дело.- 1984.- N 9.  -

5С.556.0

                 3ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

   - Подсчет относительного и абсолютного _количества. Т-лимфоци-

     тов. Персистирование высокихколичеств  CD8-клетокможет

     указывать на хроническую вирусную инфекцию. /1575к/90/ Ко-

     личество СD45+0-клеток снижается при СПИДе.

   - Определениемедиаторов клеточного иммунного ответа /ИО/ в

     крови и тканях (ИЛ-2).

   - Развитие клеточного _иммунного ответа..

   - Определение функциональной_активности.иммунокомпетентных

     клеток:

     -- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип, по-

        ликлональная активация митогенами, антигенами в смешан-

        ной  культурелимфоцитов/СКЛ/,  тестыТ-хелперной и

        Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ,

        цитотоксическая активность,кожные тесты ГЗТ на тубер-

        кулин, стрептокиназу, кандидин и пр.),

     -- пролиферация мононуклеарных клеток (реакция бласттранс-

        формации на митогены:ФГА, Кон А, митоген лаконоса /на

        Т- и В-лимфоциты/),

     -- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА.

   - Определение ферментов лимфоцитов.

   - Определение морфологии лимфоцитов.

           2ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

   Иммунопатологические состояния проявляются

   - повышенной реактивностью

   - сниженной реактивностью (иммунодефицитами).

   Возможно сочетание данных состояний (в старости), разная ре-

акция на разные АГ.Поэтому данные два противоположных состоя-

ния можно лечить одними и теми же иммуномодуляторами (имммунос-

тимуляторами).

   4Иммунопатологические состояния проявляются развитием преиму-

4щественно 4 основных синдромов:

   4- аллергического синдрома (ГНТ-1)

   4- аутоиммунного синдрома (ГНТ-2)

   4- инфекционного синдрома (ИД)                     │

   4- лимфопролиферативного синдрома (недостаточность │ИД

                                    4апоптоза-?)      │

                   3ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОДЕФИЦИТОВ

5(+ см. ИД в лекции по иммунопатологии)

   - Снижение функциональной активности лимфоцитов,моноцитов,

     нейтрофилов

     -- сниженный уровень антител.

   - Снижение количества иммунокомпетентных клеток.

   - Падение комплементарной активности.

   - Сниженная реакция лимфоидных органов на инфекцию (незначи-

     тельное увеличение ЛУ на локальный воспалительный очаг).

   - Кожный тест с пирогеналом.Внутрикожно вводят пирогенал и

     измеряют величину возникающей эритемы. При ее размере 4-10

     мм диагносцируют нормальную реактивность.Значения, выхо-

     дящие за рамки этих пределов, трактуются как сниженные или

     повышенные. /1652к/

                  5Диагностика недостаточности

                     5Т-системы иммунитета

   5Клиническая картина ─────нет

5│да

5│

   5Кожная реакция на туберкулин ───── нет

5│отрицательная

5│

   5Индекс стимуляции лимфоцитов Кон А или ФГА ───── менее 15

5│более 15                                  │

5│                                          │

   5Вспомогательные клетки ───── менее 400/мл ───────нет

5│более 400/мл                              │

5│                                          │

   5Соотношение лимфоцитов с CD 4/CD 8 ────────────── более 1

5│менее 0,8

5│

   5Недостаточность Т-системы иммунитета

           3ВЫЯВЛЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

   4Основным методом диагностики ГНТ является сбор "аллергологи-

4ческого" анамнеза, основной задачей которого является выяснение

4связи заболеваний с наследственной предрасположенностью и дейс-

4твием аллергенов внешней среды.

   4ГНТ 1 типа. Анамнезотягощен и есть связь заболевания с ал-

               4лергенами.

   4ГНТ 2 типа. То же, но связь не выявляется. Необходимо специ-

               4фическое обследование.

   4ГНТ 3 типа. Анамнезне отягощен и нет влияния аллергенов. В

               4обследовании аллергологов не нуждается.

   4Обследование больных с ГНТ использует те же приемы и методы,

4что и при других заболеваниях, т.е.

   4- общий осмотр,

   4- объективное обследование по органам и системам,

   4- специфическая лабораторная диагностика. /2300к/

   _Диагностика с использованием кожных проб..

   Время реакции

   - при ГНТ 1 типа через 1-30 минут. Реакция обусловлена анти-

                    телами класса Ig E.

   - при ГНТ 3 типа реакция через 4-12 часов (с участием иммун-

                    ных комплексов, содержащих Ig M, Ig G).

   - при ГЗТ 4 тип (Тк) - через 24-48 часов.

_ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ I ТИПА

   Основная черта аллергического статуса являетсячувствитель-

ность к аллергенам экзогенного происхождения.

   Аллергологическое обследование включает 2 вида методов:

   1. Провокационные тесты (кожные пробы).

   2. Лабораторные методы.

   - Выявление анафилатоксинов (профилактика анафилатоксическо-

го шока)

   (2Клиническая диагностика.0)

   В острый период аллергического заболевания специфические ме-

тоды отрицательные,а использование аллергеновможетусилить

обострение, поэтому специфическое обследование проводят в пери-

од ремиссии.

   1Диагностические критерии аллергии

   - наличие характерных анамнеза (наследственнойпредрасполо-

женности и пр.) и клинических проявлений

   - пароксизмальное приступообразное течение и быстро наступа-

ющая ремиссия при элиминации аллергенов или провоцирующих  фак-

торов, наоборот, резкое их обострение при повторном воздействии.

   - эозинофилия крови,мокроты, секретов и других биологичес-

ких жидкостей и выделений

   - характерноепоражение  тканейприместном аллергическом

процессе

   - положительные кожные пробы со специфическим аллергеном

   - положительные провокационные тесты с аллергенами илипри-

чинными факторами

   - наличие в значительном количестве специфических Ig E-анти-

тел в сыворотке крови и секретах,увеличение уровня неспецифи-

ческих Ig E, выявление Ig G4, обнаружение пассивно-сенсибилизи-

рованных ТК, базофилов и других лейкоцитов (нейтрофилов)

   - выявление аллерген-специфических лейкоцитов

   - положительныепровокационныетесты на медиаторы аллергии

(гистамин и др.)

   - эффективность специфической и неспецифической антиаллерги-

ческой терапии (антигистаминные препараты, КС и др.). /2300к/

   2Биологическая диагностика0.

   1Правила постановки кожных проб.

   4- Кожныепробы ставятся в период ремиссии (через 1-2 недели

     4после обострения). При этом должны быть в наличии

     4-- средства оказания неотложной помощи,

     4-- противошоковый набор.

   4- У аллергена должны отсутствовать токсические свойства, до-

     4за и объем минимальны.

   4- Перед постановкой пробы берут кровь для лабораторного исс-

     4ледования, так как возможна дисенсибилизация.

   4- Пробы не ставят с веществами, в ответ на которых был шок.

   4- Адекватный набор кожных проб иправильная  последователь-

     4ность их применения (от менее чувствительной, но более бе-

     4зопасной /накожной/ к более чувствительным/внутрикожной/

     4и опасной). /2300к/

   1Противопоказания для проведения кожный проб0.

   41. Острыйпериод  аллергического или любого другого средней

4степени тяжести или тяжелого заболевания.

   42. Во  время беременности,кормления ребенка и в первые 2-3

4дня менструального цикла.

   43. Присутствиеубедительного  анамнеза. /2300к/

   1Интерпретация результатов кожных проб0.

   _1. Ложноотрицательные бывают

   4- при угнетении кожной реакции на фоне приемаантигистамин-

4ных препаратов, бета-адреномиметиков, кортикостероидов, у детей

4до года и пожилых людей (ИД),

   4- недостаточнойчувствительностикожи (слабая фиксация ал-

4лергена)

   4- при низкой концентрации аллергена

   4- при десенсибилизации на аллерген (при постоянномконтакте

4с ним). /2300к/

   _2. Ложноположительные реакции могут быть

   4- при  псевдоаллергических реакциях,  если вводимый препарат

4обладает раздражающими свойствами

   4- при постановке проб в острый период аллергической реакции,

4когда кожа повышенно реагирует на раздражитель

   4- при введении внутрикожно больших объемов растворов,вызы-

4вающих дегрануляцию ТК от сдавливания тканей.

   4- при недостаточной частоте аллергена в наличии в нем приме-

4си других веществ, вызывающих аллергическую реакцию. /2300к/

   2Лабораторная диагностика0.

   _1) Анализ крови

   Важным признаком аллергии являетсяэозинофилия  (увеличение

на 2-4% от нормы или более 500 в 1 мкл крови).

   _Гиперэозинофилия. наблюдаетсятакже 4при паразитарных инвази-

4ях,эозинофильных инфильтратах легкого и кишечника, коллагено-

4зах,эозинофильных лейкозах, лимфогранулематозе, введении эст-

4рогенов и андрогенов, блокаде бета-рецепторов. Глюкокортикосте-

4роиды, наоборот, приводят к исчезновению эозинофилов. /2300к/0

   _2) Определение антител в сыворотке крови больных

   4- реакции преципитации, РНГА (РПГА).

   4- ИФМ (иммуно-флюоресцентный метод),

   4- Радио-аллергосорбентный тест. /2300к/

   4- Антиглобулиновыереакции  (соспецифическим аллергеном).

     4/2300к/

   3_) Определение гистамина..Непрямой и прямой тест дегрануля-

ции базофилов и тучных клеток (ТК). /2300к/

   4) Определение простагландинов, _лейкотриенов.. /2300к/

   5) Определение функционального состояния системы гипофиз-ко-

ра надпочечников. /2300к/

   6) Реакция _агрегации тромбоцитов.. /2300к/

   а) 1При лекарственной аллергии:

   - ускорение СОЭ

   - лейкопения

   - тромбоцитопения

   - агранулоцитоз

   - гемолитичиеская анемия. /2300к/

   1б) При бронхиальной астме

   - в мокроте обнаруживаются кристаллы Шарко-Лейдена,

     эозинофилия (в мокроте)

     (без увеличения количества микробов). /2300к/

   5- рентгеноскопия,рентгенография, эндоскопический и эхогра-

5фический методы диагностики. /2300к/

   2Кожные пробы.

   1) _"Проба на эозинофилы"..

   Сравнивается число эозинофилов в капле крови,полученной из

очага кожной реакции и в симметричном участке нормальной  кожи.

При увеличенииихчисла в пораженном участке более чем на 10%

заболевание считается аллергическим. /2300к/

   2) "_Проба на ТК. (тучные клетки)".

   Дермографизм отражаетреактивность  кожи,еекапилляров и

ВНС. Его оценивают на коже груди, живота или спины после прове-

дения нескольких полос тупым твердым предметом.Иногда исполь-

зуют специальные дермографы,позволяющие оценить силу надавли-

вания на кожу. Обычно через 15 секунд появляется эритема по ли-

нии надавливания,а затем возникает отечность.В нормелиния

надавливания слабая или умеренная, красная быстро исчезает. Ур-

тикарный слой в виде отечных белых полос наблюдается при масто-

цитозе (пигментная крапивница),повышенной лабильности нервной

системы, некоторых аллергических заболеваниях (атопическом дер-

матите), появляетсясразупосле  надавливания на кожу и может

сохраняться от 30 минут до суток, сопровождаться зудом. /2300к/

   - _Реакция Праустница-Кюстнера. - реакция пассивногопереноса

сенсибилизации(перенос  сывороткой крови здоровому человеку).

На первом этапе несенсибилизированному реципиенту вводят  внут-

рикожно в предплечье 0,05-0,1мл сыворотки крови больного аллер-

гией в несколько точек на расстоянии не менее 6 см. Затем через

24-48 или 72 часа в эти места, а также в участки введения анти-

сыворотки (самого реципиента) и разводящей жидкости  (контроль)

делают внутрикожно разрешающую инъекцию аллергена  по0,02мл

(на расстоянии 0,5-1 см от точки введения сыворотки). В одно из

мест введения сыворотки крови больного вместо аллергена  вводят

его растворитель (контроль). Реакция возникает в случае взаимо-

действия антител введенной сыворотки крови больного и  аллерге-

на.Ее результат учитывют через 20 мин после иньекции аллерге-

на,так же как в/к пробу.Если использовать разведенную сыво-

ротку,то можно определить ее титр. Минимальное время, необхо-

димое для фиксации реагинов,составляет 3 ч.Однако в связи с

возможностью переноса вирусного гепатита и СПИДа, а также с на-

личием других методов диагностики в последнее время реакция ут-

ратила свое значение.Более приемлемо ее применение в комбина-

ции "больной ребенок - реципиент один из родителей". Иногда ал-

лерген вводят не в/к, а через рот (например, пищевой продукт).

   3) _Пробы на аллергены. (аллергическиепробы).  Недостаток-

добавочная аллергизация организма.

   -- конъюнктивальные

   -- назальные

   -- ингаляционные

   -- кожные (скарификационные, внутрикожные, пробы уколом, на-

      кожные /капельные, аппликационные, компресные, электрофо-

      ретические/) /2300к/,

   -- экспозиционные

   -- подъязычные

   -- пероральные(с  регистрациейпо изменению картины крови

/лейкопенические, тромбоцитопенические,  эозинофилоцитопеничес-

кие/, по подавлению миграции лейкоцитов in vivo в коже или сли-

зистых, по изменению функции внешнего дыхания).

   В основе провокационных тестов лежит специфическая вторичная

повышенная иммунная реакция на вводимыйворганизм  аллерген.

/2300к/

   Различают аллерген-специфические и неспецифическиепровока-

ционные тесты.

   - _Специфические.основаны  навызове аллергической ответной

                    реакции шоковых тканей и органов к специфи-

     ческим  аллергенами 5регистрация результатов этих реакций

     5по ряду показателей.0 /2300к/

   - _Неспецифические.тесты  позволяют выявить состояние гипер-

                     чувствительности различных тканей к медиа-

     торам аллергической реакции (гистамину,АХ-ну, брадикини-

     ну,  серотонину,простагландинам и другим) или неспецифи-

     ческим раздражающим факторам (холод, физическая нагрузка и

     др.). /2300к/

     -- Ингаляционныес  бронхоконстрикторами(смедиаторами

        /гистамин,АХ,Pg F42-альфа0, брадикинин, серотонин/, с

        неспецифическими раздражителями /холодный воздух, физи-

        ческая нагрузка/). /2300к/

     -- Ингаляционные с бронходилататорами (селективными стиму-

        ляторами бета-2-адренорецепторов /беротек/, с холиноли-

        тиками /атропин или атровен/, с ингибиторами фосфодиэс-

        теразы /теофиллин,эуфиллин/,  с медиаторами /PgE/).

        /2300к/

     -- Кожные неспецифические (с медиаторами /гистамин/,дер-

        мографизм). /2300к/

   Количественные тесты указывают на степень чувствительности к

аллергену или фактору,а качественные - на специфичность реак-

ции.

   _2Профилактика и лечение.0 аллергий

   Гипосенсибилизация более 70 лет является основой лечения ал-

лергий респираторного тракта.

   _1. Препараты, оказывающие действие на иммунную стадию

   - Влияющие на процесс образования Ig E. /2275к/

     -- повторноевведение  увеличивающихся доз аллергена (за-

        пуск синтеза Ig G ──760 блокада АГ до подхода к ТК)

        (получение чистыхиндивидуальных аллергенов --- преры-

   +-     вистые повторные инъекции экстратов АГ  наадъювантах;

        повышение интервалов между инъекциями)

     -- введение per rectum (запуск пероральной толерантности)

     5-- индукцияиммунологическойтолерантности   (супрессией

        5синтезаIg E адъювантом Фрейнда;переводом АГ в толе-

        5рантную форму, т.е. формирование клеток-супрессоров)

   - Влияющие на связывание Ig E cFc(Е)-рецепторами. /2275к/

     -- введение Fc-фрагмента Ig E

     -- введение 1-валентного аллергена

     -- введение анти-Ig E

     -- модификация антигенных детерминант аллергена

   1- Регуляция гамма-ИФ-ом:ИФ является прямымантагонистом

1ИЛ-4 в ИЛ-4-индуцированной продукции Ig E. /2262к/98/

   1- Влияющие на синтез ИЛ-ов, участвующих в Ig E-ответе. /2275к/

   1-- ИЛ-10 (предотвращающего ИЛ-4-индуцированный синтезIgE

1путем ингибиции вспомогательной функции моноцитов)0.1 /2262к/98/

   1-- ИЛ-12,регулирующего уровень секреции ИФ-гамма,ИЛ-4и

1ИЛ-10 антигенспецифическими лимфоцитами. /2262к/98/

   1- ИЛ-8 селективно ингибирует Ig E-продукцию ПК-ми, индуциро-

1ванными ИЛ-4-ом0.1 /2262к/98/

   _2. Препараты, оказывающие действие на патохимическую стадию.

   - Стабилизаторы мембран клеток-мишеней аллергии. /2275к/

     -- гормональная терапия (преднизолон и пр.),

     -- препараты кетотифен,промогликат-? Nа --- стабилизация

        мембраны ТК.

   - Соединения,тормозящие активацию этих клеток (влияющие на

поступление и либерацию ионов кальция, на синтез и обмен медиа-

торов аллергии,на систему аденилатциклаза-цАМФ-фосфодижстера-

за). /2275к/

   -- группа  кромолинов(кромогликат натрия - интал) угнетает

      освобождение медиаторов из ТК. /2275к/

   _3. Препараты,оказывающие  действиена патофизиологическую

_стадию. /2275к/

   - Антагонистымедиаторов  аллергии (гистамина,серотонина,

ЛТ-ов, ФАТ). /2275к/

     -- антигистаминные средства (цетиризин = зиртек) /2275к/,

     -- бронхолитики,

   - Соединения,снижающие чувствительность эффекторных тканей

к аллергии (стимуляторы бета-адренорецепторов, альфа-адренобло-

каторы, ингибиторы М-холинорецепторов). /2275к/

   4. Препараты, оказывающие действие одновременно на различные

стадии аллергическогопроцесса - _полифункциональные (глюкокор-

тикостероиды, кетотифен). /2275к/

_ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ II ТИПА

   Аутоиммунными принято считать те заболевания, в основе кото-

рых лежит иммунная реакция на собственные антигены тканей и ор-

ганов.

   1Причины и механизмы заболевания

   - Измененные собственные АГ.

     -- Индуцированный вирусами и другимиагентами  мутациии

        модификации активности аутогенов - онкогенов, регулиру-

        ющих продукцию цитокинов и их рецепторов.

   - Нарушение барьеров "забарьерных органов" или физиологичес-

     ки изолированных АГ-ов.

   - Нарушение распознавания "своего" и "чужого" (данныеимму-

     ногенетики).

     -- Антигенная мимикрия аутоАГ и АГ микробов.

   - Активация аутоактивных клонов лимфоцитов

     -- снижение функции клеток-супрессоров.

     -- снижениеапоптоза Тх,  активирующих В-лимфоциты (CD5).

        /2300к/

   - Нарушение иммунологической сети идиотип-антиидиотип (выяв-

ление свободных антиидиотипических антител).

   - Индукции экспрессии HLA DR-антигенов, их не имевших,

   2Диагностика

   Диагноз аутоиммунных заболеваний может быть поставлен на ос-

новании клинической картины заболевания, лабораторных показате-

лей.

   1Критерии аутоиммунных заболеваний0.

   - Наличие четких доказательств участия АТ в поражении клеток

     (наличие аутоантител различной специфичности),

   - положительный клинический эффект от леченияиммуномодуля-

     торами

   - эффективность десенсибилизации. /2300к/

   1Анализ крови0:

   - снижение Т-клеток (особенно Тs),

   - увеличение числа В-лимфоцитов

   - поликлональная гипер- или дис-иммуноглобулинемия

   - ИК в крови

   - снижение концентрации комплемента /? - ПОЛ/

   (- определение уровня ИЛ-1,ИЛ-2, ФНО, лимфо- и цитокинов).

/2300к/

   2Кожные пробы0: (клеточные реакции)

   4Экстракты аллогенных тканей в качестве антигенов малопригод-

4ны, так как они могут стимулировать лимфоциты в результате гис-

4тонесовместимости.К некоторым из них может наблюдаться сенси-

4билизация (после переливания крови и пр.). Чтобы контролировать

4активность лимфоцитов на аллоАГ контрольные АГ должны быть при-

4готовлены из другой ткани того же индивидуума.  Если сенсибили-

4зации к тому АГ нет, а к опытному АГ есть, то только тогда мож-

4но делать заключение о ее тканевой специфичности. /2300к/

   4ГНТ 2-го типа осложняется ГЗТ.

   2Лабораторная диагностика0 (см. отд-е формы)

   - Определение антител, связанных с клетками

   3Температурные реакции

   - Кожные неспецифические (холодовые, тепловые) пробы.

   1) Протеины теплового шока ("_тепловая аллергия.")

   4Протеины тепловогошока (ПТШ) локализуются внутриклеточно и

4на клеточной поверхности.В частности,иммунную  рольиграет

4пептид 180-188 (ПТШ65),индуцирующий Т-клеточный ответ, корре-

4лировавший с тяжестью заболевания. /2289к/96/

   4Иммунизация ПТШ65 может защитить мышь от индукцииадъювант-

4ного артрита. В артритных тканях мышей обнаружены пептиды ПТШ60

4и ПТШ70,в крови - Т-клетки и антитела к ПТШ65. Ragno постули-

4ровал существование механизма молекулярной мимикрии для инициа-

4ции и пролонгации артрита. /2289к/

   4ПТШ60 обнаруживаются на макрофагах,активированных гамма-ИФ

4и альфа-ФНО. /2289к/

   1Кожная проба0: Пробирку с горячей водой (40-425о0С) помещают на

10 минут на кожу внутренней поверхности предплечья. При положи-

тельной реакции через 15-20 минут наблюдается гиперемия,  отек,

волдырь. /2300к/

   2) "_Холодовая аллергия."

  1Кожная проба0:  кусочекльдапомещают на предплечье и через

10-20 минут на этом месте появляются волдыри при непереносимос-

ти холода. /2300к/

   3Аутоиммунное заболевание щитовидной железы

   _1) Тиреоидит Хашимото.

   1Лабораторная диагностика

   4- HLA B8 и DRS. /2300к/

   4- Аутоантитела против АГ к тиреоглобулину(РСК,ИФА,РПГА,РП,

     4РИМ, латексный метод). /2300к/

   4- АТ против микросомных АГ и "второго коллоидногоАГ"(ис-

     4пользуют непрямую иммунофлуоренценцию на срезах щитовидной

     4железы./2300к/

   4- АТ   противосновногобелка  микротрубочек-тубулина.

     4/2300к/

   4- АТ против поверхности клеток эпителия. /2300к/

   4- Подавление тироксином миграции лимфоцитов. /2300к/

   4- Цитотоксическое действие лимфоцитов наразличныеклетки,

     4покрытые АГ-ом железы /2300к/ (Тк=4 тип ГЗТ-?).

   4- Повышено количество Тх2 типа с рецептором к ИЛ-2 вкрово-

     4токе. /2300к/

   4- Cоотношение Тхк  Тs(CD4/CD8)повышено  незначительно.

     4/2300к/

   _2) Тиреотоксикоз.

   - АТ, стимулирующие гиперплазию эпителия.

   - Стимулятор щитовидной железы (LATS).

   - АТ,  стимулирующие накопление в щитовидной железе коллоида

и цАМФ.

   - АТ,  ингибирующие связываниетиреотропинас  рецепторами

клеток

   - Снижение числа CD8-лимфоцитов и повышение соотношения Тх к

Тs (CD4/CD8). /2300к/

   _Сахарный диабет

   5Инсулинзависимый сахарный диабет - аутоиммунное заболевание;

5аутоиммунная реакция приводит к разрушению инсулино-продуцирую-

5щих клеток.Больные имеют высокий риск развития других аутоим-

5мунных заболеваний.Часто развивается поражение щитовидной же-

5лезы - аутоиммунный тиреоидит или болезнь Грейвса. /2239к/95/0

   _1) Первый тип (инсулин-зависимый)

   4Приобретая DR-АГ, бета-клетки становятся АПК (АГ-презентиру-

4ющими клетками), запускающими ИО. Появление DR-АГ на бета-клет-

4ках под влиянием ИФ,индуцируемого некоторымивирусамиили/и

4стимуляция ими синтеза макрофагами ИЛ-1 и ФНО, повреждающих бе-

4та-клетки. /2300к/

   4Особую проблему представляет сенсибилизация больных кинсу-

4лину животного происхождения (Ig G и Ig A).

   _2) 2-ой тип

   4АТ к рецептору для инсулина /?/

   4Лабораторная диагностика:

   4- Генетическая предрасположенность (HLA DR 3/4,иособенно

4HLA DQ, А1 и HLA DQ, В1. /2300к/

   _Рассеянный склероз

- Ассоциирован с АГ HLA A3, B7, DR2. /2300к/

- Повышено содержание Ig в спинномозговой  жидкости(СМЖ),_2АТ

_2против белка миелина.0 СМЖ и крови.

- Общее количество Т-лимфоцитов не меняется или снижено.

- Повышено количество В-лимфоцитов.

- Повышен уровень Тх (CD4+-лимфоцитов), ИЛ-2

- Снижено количество Тs, на которых в 3 раза повышено число бе-

та-адренорецепторов.

- На моноцитах снижена экспрессия DR-АГ.

- В СМЖ обнаруживаются МИФ (миграции-ингибирующий фактор), ФНО,

гамма-ИФ. /2300к/

   _Миастения гравис

   2- АТ  противАХ-ых рецепторов и АХЭ0 (ацетилхолинэстеразы) -

490% больных. /2300к/

   4- АТ против АГ скелетных мышщ.

   4- Имеется связь между АГ мышечной ткани и АГ вилочковойже-

4лезы (тимуса).Тимэктомияприводит  кклиническому улучшению

4состояния больных /2300к/ - у 30%-?.АТ могут интенсивно взаи-

4модействоватьс комплексом тимопоэтин-АХ-ый рецептор (тимопоэ-

4тин снижает нервно-мышечную передачу импульсов). /2300к-с.136/

   4- УровеньТ-клеток нормальный,но снижается после тимэкто-

4мии, хотя состояние больных улучшается.

   4- Супрессорная активность клеток умеренно уменьшена.

   4- Увеличена субпопуляция Т-клеток, имеющих СR1/?/-рецепторы.

   4- Сниженацитотоксическаяактивность  ФГА (фитогемагглюти-

4нин)-активированных Т-клеток. /2300к/

   3Шизофрения

   - аутоиммунная форма

                3Антифосфолипидный синдром0 (АФС)

         (Синдром ПФА - противофосфолипидных антител)

──────────┬──────────────────────────────────────┬─────────────

Компоненты│         Патогенное действие          │Лабораторные

гемостаза │      антифосфолипидных антител     │проявления

──────────┼──────────────────────────────────────┼─────────────

Сосудисто-│Взаимодействие с мембраной тромбоцитов│Тромбоцито-

тромбоци- │--- повышение адгезии к ЭК --- подав- │пения

тарный    │ление выработкипростациклина --- АТ │

         │                                      │

Коагуляци-│Торможение образования протромбинового│Повышение

онный     │комплекса (фактора V+X+Ca+ФЛ), блокада│протромбино-

гемостаз│действия на протромбин                │вого времени

          │Повышение способности тромбина катали-│

          │зировать образование свертка крови    │

          │                                      │

Противо-│Снижение синтеза эндотелием тромбомо- │

свертываю-│дулина --- снижение активности белка С│

щая систе-│Подавление активности АТ-III.         │Снижение АТ-

ма        │                                      │III

          │                                      │

Фибриноли-│Ингибиция образования прекалликреина. │Замедление

тическая│Нарушение клиренса фибрина (активная│лизиса эугло-

система   │фаза фактора ХII + калликреин + ВМК). │булинов

          │Снижение выделения активатора плазми- │

          │ногена.                               │

──────────┴──────────────────────────────────────┴─────────────

   _Лабораторная диагностика:

   - наличие  антител к фосфолипидам /3609/ --- эффект антикоа-

     гулянта (блокада образования протромбиназы). /3609/86/

   - АТ  типаволчаночного увеличивают время рекальцификации в

     присутствии различных видов фосфолипидов. /8000/87/

   - удлинение протромбинового времени /3615/82/,

   - удлинение  активированного(каолином) частичного тромбо-

     пластинового времени. /8001/89/

   - снижение уровня белка S, снижение белка С /7999/

   5Фибринолитическая активность снижается. /3615/82/ Тормозится

5Хагеман-зависимый фибринолиз (Табл.1) /определение каолин-за-

5висимого фибринолиза по Ogston /3615-11/. /3615/82/

                                            5Таблица 1.

5───────────────────────────────────────────────────────────────

           5Плазма                    │Время лизиса (мин.)

5───────────────────────────────────────────────────────────────

5Нормальный уровень                          7-14 минут

5Врожденный дефицит прекалликреина           более 120 минут

5Врожденный дефицит фактора ХII              более 120 минут

5Больные СКВ25,

                                            575,

                                            515 минут

5───────────────────────────────────────────────────────────────

5Снижается уровень активатора плазминогена  эндотелиальныхкле-

5ток. /3615/82/

           _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ III ТИПА

   2Лабораторная диагностика

   - Реакции лизиса и повреждения лейкоцитов

   - Определение ЦИК (повышенный уровень)

   - Снижение уровня комплемента/с/

   - Повышение титра АТ /с/

   - повышение СРБ /с/

   - ПОЛ /с/

                        2Определение ЦИК

              (циркулирующих иммунных комплексов)

   _Значение теста.. Содержание ИК помогает в оценке и мониторин-

ге активности болезни при таких состояниях,как РА, СКВ. Опре-

деление АГ-специфических ИК может оказаться полезным при обсто-

ятельствах, когдасвободныеАТ  всывороткене  выявляются.

/1575к/90/

   _Варианты методик

   1) Биологический тест

   - Тест угнетения ЕА-розеткообразования (FcR) лимфоцитов боль-

ных под влиянием 10-20%аутологичной сыворотки (контроль сыво-

ротки доноров).Причем,данный тест болеечувствителен,  чем

другие методы.

   - Реакция   коагглютинации    (агглютинация    стафилококков

сывороткой больных. /с/

   - Агглютинация эритроцитов, покрытых белком А (FcR) золотис-

того стафилококка. /2300к/

   - ЦИК выявляют с помощью клеток (тромбоцитов,клеток Райи),

имеющих Fc-рецепторы,которые связывают агрегированные Ig. ЦИК

угнетает связывание с FcR частиц, например, эритроцитов, покры-

тых агрегированных иммуноглобулинами или АТ-ми. /2300к/

   2) С1q-cвязывающий тест

      ИК= АГ+АТ

      АТ=Fab+Fc

      Fc + C1q, иммобилизованный на носителе (колонке с сефаро-

зой).

   Пропускают сыворотку больного через колонку, промывают, сры-

вают (высокомолярным, "кислым" /рН 3/ и пр. раствором) лиганд и

измеряют элюат спектрофотометрически.

   Недостаток: ЦИК кровотока,связанные с С1q, не сядут на ко-

               лонку.

   3) _Осадочные реакции. (желательно с последующимопределением

в осадке содержания антител /посадкой на колонку с C1q/).

   Недостаток: в осадок выпадают все крупныекомплексыплазмы

(обрывки мембран,фибрина,СРБ-лиганд,  фибронектин-лиганди

пр.). /с/

   4а) Водно-кислотные методы.

   4- Сыворотка смешивается с 10% ТХУ (трихлоруксусной кислотой)

4в соотношении 1:0,5.Надосадок после центрифугирования измеря-

4ется на спектрофотометре при длине волны 254нм. Экстинция менее

40,24 ед.считается нормой. 10% ТХУ определяет (в конечной кон-

4центрации 3,3%) осаждает белки с М. более 100 кД.

   4- Осаждение "ЦИК" дистиллированной водой,подкисленной о,1М

4раствором уксусной кислоты (рН 4,6).

   4К 0,1 мл инактивированной сыворотки добавляют 2 мл охлажден-

4ной до 4оС воды,перемешивают и центрифугируют30  минутпри

43000 об./мин.(при 4оС).Осадок промывают подкисленной водой,

4растворяют в 3 мл 0,1Н NaOH иизмеряютколичество  белкапри

4280нм, т.е. количество ЦИК. /2300к/

   4б) Осаждение ПЭГ (полиэтиленгликолем)

   4ПЭГ добавляется в определенное количество сыворотки, образу-

4ется осадок, который растворяют в физрастворе и спектрофотомет-

4рируют.

           43% ПЭГ - Норма - 23-124 (показания СФ)

           44% ПЭГ - Норма - 90-148

   4[4) Конглютининовый тест]

   45) АГ-специфические методы(после  выделенияспецифических

4ЦИК) базируются на выявлении АГ-ов или АТ после диссоциации ЦИК

4при рН 2,8-3,2 или путем обработки раствором мочевины, цистеина

4и других веществ. /2300к-с.234/

   3Коллагенозы

   5- иммунная патологиядиффузных  заболеваниясоединительных

5тканей.Возможен врожденный волчаночный синдром (+ АТ к ДНК, +

5врожденный порок сердца). Характерен дефицит С2.

   _5Патогенез

   5В норме антинуклеарные,антицитоплазматические иантимито-

5хондриальные антитела выявляются в высоком титре (> 1:160) у 1%

5здоровых обследованных (уровень существенно повышается  своз-

5растом). /2258к/

   5Антисыворотки против нуклеарных АГ:

   5- WHO 66/233, WHO 4/80.

   5- Стандарты АГ -AF#CDC ANA No1; AF/CDC No 3, N 4, N 8.

   _5Клиническая картина

   5Клиническая картина СКВ характеризуется полиморфизмом. Долж-

5но быть не менее 4 признаков.

   51. Недеформирующий артрит (80-90% больных).

   52. Наличие LE-клеток (70-90%).

   53. Цилиндроурия (15-50%), плеврит или перикардит (50-70%),

   54. Алопеция (облысение) - (40-70%)

   55. Эритема лица в форме бабочки (40% больных)

   56. Синдром Рейно (20-40%)

   57. Повышенная чувствительность к УФ лучам (30-40%).

   58. Дискоидная волчанка (20-30%)

   59. Изъязвление в полости рта или носоглотки (15-40% больных).

510. Выраженная протеинурия (более 4 г/л), 15-30% больных.

511. Психозы или судорожные припадки (10-20% больных).

512. Гемолитическая анемия (15%),

513. Лейкопения (ниже 4х109л-1) /40% больных/ или

      5тромбоцитопения (ниже 100 х109 л-1 (10% больных),

      5лимфопения.

514. Положительная реакция Вассермана в течение 6 месяцев(АТ

      5к кардиолипину).

   _5Лабораторная диагностика

   5- снижение уровня Т-лимфоцитов,преимущественноеугнетение

    5Тs;

   5- снижение ИЛ-1 макрофагами и моноцитами, ИЛ-2

   5- уменьшение нормальной концентрации в сыворотке крови С4и

     5С2 компонентов комплемента

   5- поликлональная активация В-системы

   5- повышение уровня АТIg G1, G3.

   5- АТ к ДНК и АТ 2-го порядка (АТ к АТ)

   5- наличие АТ против определенных субпопуляций лимфоцитов

   5- связь с HLA гаплотипом А2, B7, В8, D3,

     5или с гаплотипом А11,B7,  В35,DR2,DR3; рекомендуется

     5обследоватьродственников  больного для выявления ранних

     5форм заболевания. /2300к/

   3Склеродермия

   5- Нарушение функции фибробластов (несовершенный коллаген)

   5- Антиядерные АТ (80% больных)

   5- антифосфолипидные АТ,

   5- АТ к Scl (70%)

   5- АТ к РНК-полимеразам, топоизомеразе ядер

   5- ревматоидный фактор (РФ) - антитела класса Ig M к Fc-фраг-

     5менту Ig G и Ig Е. /2300к/

   5- АТ против центромеры

   5- лимфоцитотоксины

   5- гипер-гамма-глобулинемия,

   5- ЦИК

   5- снижение уровня Т-лимфоцитов. /2300к/

   3Синдром Шегрена

   5Шегрен в 1933г.описал синдром,состоящий из трех основных

5симптомов:

   51. сухого кератоконъюнктивита, │sicca-синдром

      5(ксерофтальмия-?)           │

   52. ксеростомии,                │

53. ревматоидного артрита. Ревматическое поражение начинается

5раньше, к нему присоединяется поражение слюнных желез. /1407к/

   5+ синуситы,

   5+ сухость кожи,

   5+ анацидность,

   5+ цистит, пиелит,

   5+ анемия,СКВ, макроглобулинемия, полимиозит, склеродермия,

5васкулит, узелковый периартериит,иммунный тиреоидит, иммунный

5гемолиз и прочие аутоиммунные болезни. /1407к/

   5Болезнь характеризуется разрушением железистого эпителияво

5всем организме. /1407к/

   _5Этиология

   5Аутоиммунный процесс.Органоспецифические аутоантитела про-

5тив0

   5- щитовидной железы,

   5- слизистой желудка,

   5- мышц,

   5- ревматоидный фактор (Ig G против Ig M),

   5- противоядерный фактор. /1407к/

   _5Патогенез

   5В слюнных железах лимфоцитарная инфильтрация,в первую оче-

5редь вокруг полосатых протоков. В эпителии протоков наблюдается

5пролиферациялимфоцитов,  эпителий ацинусов погибает (остаются

5островки пролиферирующего эпителия). = доброкачественное лимфо-

5эпителиальноепоражение.  Можетпереходитьв злокачественную

5лимфосаркому. /1407к/0

   5- Лейкопения

   5- РФ (70-90%)

   5- антиядерные АТ (50-70% больных)

   5- АТ к АГ слюнных желез

   5- снижениеТ-клеток  исоотношенияCD4/CD8=Тх/Тs   (норма

51,5-2,5). /2300к/

   _5Клиника

   5- Набуханиеслюнных желез,

   5- сухость во рту (в тяжелых случаях у больного полностью от-

5сутствует слюна). В таком случае затруднено глотание.

   5- По всему телу прощупываются ЛУ, ревматические узлы.

   5- Депрессия. /1407к/

   _5Лечение

   5- кортикостероиды, ударные дозы преднизолона,

   5- витамин В12

   5- психо- и физиотерапия. /1407к/

   3Узелковый периартериит

   _5Лабораторная диагностика

   5- Лейкоцитоз

  5- Гипо-гамма-глобулинемия

   5- Антинуклеарные АТ

   5- РФ

   5- АТ против кардиолипина

   5- HBs-АГ или его АТ (30% больных). /2300к/

   3Ревматоидный артрит

   5ИК --- активация комплемента.

   5Ревматоидные узелки состоят из фибрина, лимфоцитов, макрофа-

5гов.

   _5Лабораторная диагностика

   5- РФ = аутоАТ (класса Ig M) к Fc-фрагменту Ig - ревматоидный

     5фактор (выявляются у 70-90% больных).

   5- Увеличение СОЭ

   5- Повышение СРБ

   5- Повышение альфа-2-глобулинов, а затем и гамма-глобулинов.

   5- Анемия

   5- Умеренный лейкоцитоз

   5- Генетическая связь с HLA А11,DR4,  DR53,DQ4.

   5- Наличиемуциновых  преципитатовв синовиальной жидкости.

     5/2300к/

   5- Уменьшение количества лимфоцитов. /2300к/

   5- Повышается уровень бета-2-макроглобулинавкрови  в2-5

     5раз. /2300к/

_ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ IV ТИПА

   2Лабораторная диагностика

   - Анализ крови и подсчет лимфоцитов. Количество Т-лимфоцитов

    определяют по АГ и рецепторам.

   - Рентгенологическое обследование вилочковой железы.

   - Функциональную активность Т-лимфоцитов определяют попро-

     лиферации  (РБТЛ),образованию цитокинов,лимфокинов,а

     также по цитотоксическим и регуляторным эффектам. /2300к/

   - Подавление миграции лейкоцитов.

   - Изменение прилипаемости лейкоцитов.

   - Изменение  розеткообразованияТ-лимфоцитов с эритроцитами

     барана.

   - Кожные пробы

     -- пробы с ФГА (оценивают по диаметру папул;гиперемия не

        определяется "работой" Тк-ов),

     -- динитрохлорбензолом /ДНХБ/

     --"мультитест" (набор распространенных АГ-ов). /2300к/

     -- Кожный тест с пирогеналом

   Внутрикожно вводят пирогенал и измеряют величину возникающей

эритемы. Приее размере 4-10 мм диагносцируют нормальную реак-

тивность. Значения, выходящие за рамки этих пределов, трактуют-

ся как сниженные или повышенные. /1652к/