Факторы неспецефической защиты - продолжение: Эндоцитоз, экзоцитоз, фагоцитоз, фагоцитарная активность


Примечание	Очень хорошие, полные, объемные лекции. Обилие новых материалов, подробностей, научных терминов. Очень много того, чего нет в учебниках. Короче, всем рекомендую :) Кстати, открыть можно не только Лексиконом. Подойдет любой текстовый редактор, поддерживающ
	Загрузить архив:
	Файл: 039-0087.zip (23kb [zip], Скачиваний: 82) скачать

ш0.7 Снять ?

2НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ0 (ПРОДОЛЖЕНИЕ)

ЭНДОЦИТОЗ И ЭКЗОЦИТОЗ

Фагоциты

способны осуществлять

┌────────────┴─────────────┐

│ │

либо фагоцитоз (=эндоцитоз) либо экзоцитоз

(если объект меньше фагоцита) (=внеклеточное переваривание),

если объект больше фагоцита

│

Неспецифичекий протеолиз

в кислой среде (зоне ишемии),

ПОЛ (= перекисное окисление

липидов)

│

Деструкция самого фагоцита,

объекта и "окружения" (клеток-

"свидетелей", ткани)

= инициация ВОСПАЛЕНИЯ

(при скоплении лейкоцитов)

Реакции эндоцитоза делятся на 3 типа:пиноцитоз, кэппинг и

фагоцитоз.

1. ПИНОЦИТОЗ поглощение частиц размером до 0,1 мкм безпот-

реблениямембраны (липопротеинов, вирусов).

2. РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМЫЙ ЭНДОЦИТОЗ /1559к/84/ - КЭППИРОВАНИЕ

(кэппинг) /от англ."сар" - шапка, шапкообра-

зование/ - это организованное движение диффуз-

но распределенных молекул в плоскости мембраны, приводящее к их

накоплению (шапкаподлюминисцентным микроскопом) на одном или

нескольких участках мембраны с последующим втягиванием (поглоще-

нием) внутрь.

Рис.

Например, кэппирование

- иммунных комплексов через Fc-рецепторы,

- комплексов HLA II класса + антитела к ним;

- комплексов С-РБ-лиганд,

- лигандов С3в-рецепторов,

- холерного токсина через ганглиозид GM1 (мембранный рецеп-

тор) на лимфоцитах. /1994/80/

Механизм: участвует кальмодулин/7526/; переходзоль-гель

Кэппактнины- класс белков,которые кэппируют концы актиновых

филаментов. Время кэппинга - 10 минут. /1994/

Рецепторы с лигандамилегкодиссоциируют при рН ниже 5,5.

Механизм закисления среды внутри эндосом не ясен,однакоиз-

вестно, чтов мембранах эндосом имеется фермент, который ис-

пользуя энергию,запасенную в молекулах АТФ, перекачивает про-

тоны внутрь везикул.(Избыток протонов означает понижение рН.)

Рецепторы, связанныес мембраной, вновь реутилизируются.

/1559к/84/

3. РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМЫЙ ЭНДОЦИТОЗ (ирецептор-независимый)-

ФАГОЦИТОЗ- поглощение и внутриклеточное переваривание (с пос-

ледующим экзоцитозом) микробов,чужеродных иотмерших тканей

организма, поврежденных клеток.(От слов греч. "phagos" - пожи-

раю, "сytos" - клетка.)

3Рецептор-зависимый экзоцитоз0 происходит,если объект не мо-

жетбыть из-за больших размеров поглощен фагоцитом (агглютинат

микробов,ПИК, часто собственная клетка организма человекаи

пр.). Фагоцит выбрасывает содержимое лизосом, в т.ч. МПХ, акти-

вирующую ПОЛ. В итоге деструктируются не только взаимодействую-

щие компоненты, но и окрующая ткань (клетки-свидетели). Образу-

ется зона микронекроза.(Данныймеханизм осуществляетсяпри

развитии аутоиммунных заболеваний.)

- Если связь "фагоцитируемого" объекта ифагоцитаосущест-

вляласьчерез антитела(FcR),механизм именуется как АТ-ЗКЦ

(АТ-зависимая клеточная цитотоксичность);

- если через фрагменты комплемента, то С-ЗКЦ (комплемент-за-

висимая клеточная цитотоксичность

- если через лектиновые рецепторы, то лектин-ЗКЦ;

- если через рецепторы к фибронектину или рецепторыкСРБ,

то фибронектин-ЗКЦ или СРБ-ЗКЦ и т.д.

3Исторический аспект

Явление фагоцитозаоткрыл И.И.Мечников в 1893г.,наблюдая

как клеточные личинки морской звезды поглощают краску), за что

ему в начале века была присуждена Нобелевская премия.

4Только чтовведеннные в кровь бактерии моментально исчезали

4из нее. /293/0

До 1969г. фагоцитирующие клетки включали в т.н. ретикуло-эн-

дотелиальную систему, а в 1969г. R.van Furth и соавт. предложи-

ли термин "система мононуклеарных фагоцитов" (СМФ).

3Гистологический аспект

2Система мононуклеарных фагоцитов (СМФ)0 включает:

- клетки Купфера печени,альвеолярные макрофаги, гистиоциты

соединительной ткани, клетки микроглии цнс, остеокласты, макро-

фаги лимфатических узлов, селезенки.

85-95% фагоцитирующих клеток организма сосредоточено в пече-

ни и селезенке.

СМФ делится на

1. внутрисосудистую (гистиоциты селезеночной пульпы, костно-

го мозга и лимфатических синусов) и

2. тканевую. Последняя в нормальных условиях состоит из по-

коящихся клеток (длительность жизни от 20 до 60 дней), становя-

щихся активированными гистиоцитами в случаях агрессии. /5987/86/

Активация СМФпроисходит поддействием ряда бактериальных

продуктов, токсинов, иммунных комплексов, стимулированных

Т-лимфоцитов, лимфокинов.

И.И.Мечников подразделил фагоциты на микрофаги (гранулоциты)

и макрофаги.

1. 2Микрофаги0 имеют запас гликогена, поэтому обеспечивают ос-

новную защиту в анаэробных условиях (в очагах гнойного воспале-

ния при острых инфекциях).Снижение числа нейтрофилов ниже 25%

от нормы опасно для жизни./2269к/ Фагоцитоз у макрофагов /мо-

ноцитов/ протекает медленнее,чем у ПМЛ,но бактерицидная ак-

тивность выше, чем у ПМЛ. /7073/

2. 2Макрофаги0 делятся на подвижные и оседлые.

а) Подвижные,циркулирующие макрофаги (моноциты крови, гис-

тиоциты, полибласты)осуществляютхемотаксис. Присутствуют в

селезенке,ЛУ перитонеальной полости.Имеют пероксидазную ак-

тивность в лизосомах. ЯвляютсяIа5+0-клетками,т.е. АПК.

/81-12-53-135/

б) оседлые (кпд >>>:если лейкоциты прикрепляются к волок-

нистым структурам,тофагоцитоз идетнамногоэффективнее).

Оседлые сосредоточенывсинусоидах печени и некоторых других

органов, в тканях, серозных полостях, в легких. Имеют С3-рецеп-

торы. Содержат пероксидазу в ЭПС.Не способны представлять ан-

тиген лимфоцитам. /81-12-53-135/

_3 типа гранул.:

1. МПХ, лизоцим,катионные белки. Содержимое гранул первой

группы стимулирует "окислительный взрыв". /1365к/94/

2. Лактоферрин, лизоцим.

(Лактоферрин и катионые белки в макрофагах не обнаружены;в

них меньше МПХ). /307/

5Второй тип гранул включает ферменты типакатионныхбелков,

5протеаз, лактоферрина и фосфолипады А2. /1365к/94/

3. кислые гидролазы.

4Макрофаги имеют 2 типа гранул: специфические (цитохромы, пе-

4роксидаза, гиалуронидаза, нейтральные протеазы, активатор плаз-

4миногена,эластаза, коллагеназа) и азурофильные. При дефиците

4специфических гранулнейтрофиловвоспалительнаяреактивность

4снижается, развиваются тяжелые рецидивирующие бактериальные ин-

4фекции. /7073/0

4Бета-2-микроглобулин в нейтрофилах (65% находится в специфи-

4ческих гранулах, 20% - в секреторных везикулах). /2361к/94/0

Дефензины - пептиды, богатые аргинином и цистеином с М. око-

ло 4 кД. Обладают широким спектром активности, в т.ч. модулиру-

ют взаимодействие нейроэндокринной и иммунной систем. Оказывают

стресс-протективное действие. /2287к/

Показателем защитнойфункции ПМЛ является уровень щелочной

фосфатазы (при воспалительных процессах он возрастает). /7073/

ФУНКЦИИ ФАГОЦИТОВ

1. фагоцитарная (удаление из организма отмирающих или мертвых

клеток; их фрагментов; агрегатов белков; частичек пыли и пр.),

2. синтетическая(фагоциты синтезируют компоненты комплемен-

та, интерлейкины, интерферон и др. БАВ),

3. антигенпрезентирующая (макрофаги/моноциты).

4. участие в воспалительных реакциях.

3Биохимический аспект

Факторы, участвующие в деструкции

фагоцитированного материала

──────────────────────────────┬────────────────────────────────

Кислород-зависимый механизм│ Кислород-независимый механизм

──────────────────────────────┴────────────────────────────────

МПХ (миелопероксидаза) Лизоцим

О425-0 (супероксид анион) Лактоферрин

0Н5-0 (гидроксильный радикал)Катионные белки

5100420(синглетный кислород) Нейтральные протеазы

Н420О420 (перекись водорода) Кислые протеазы

Дефензины /2287к/

NO оксид азота /?/

───────────────────────────────────────────────────────────────

Кислая фосфатаза,липаза, эластаза, бета-глюкуронидаза и ка-

тепсины важныв переработке антигена для взаимодействия с моле-

кулами HLA класса II.Обычно именно по ним идентифицируют лизо-

сомы.

2Макрофаги0 имеют обширную сеть митохондрий и шероховатой ЭПС,

поэтомув основном"работают" в аэробных условиях в борьбе с

внутриклеточными микробами (спирохетами, грибами, туберкулезной

палочкой). [Часто происходит организация мононуклеаров в грану-

лемы.] Макрофаги делятся на Ia5+0(мышей) - участвующие в иммунном

ответе, и Ia5-0, фагоцитирующие через Fc-, С3в и др. рецепторы.

_Регуляция фагоцитоза

───────────────────────────────┬───────────────────────────────

СТИМУЛИРУЮТ │ ИНГИБИРУЮТ

───────────────────────────────┼───────────────────────────────

Интерферон │ ТФР-бета (тромбоцитов ...)

Лейкоцитарная масса│

ЛПС грамотрицательных микробов │ Аминогликозиды (< хемотаксис)

(перекрестная стимуляция ЛПС │ Тетрациклины /7506/

и др. продуктами микробов) │ Экзотоксины бактерий

СРБ │ Некоторые эндотоксины бактерий

Пептидогликаны │ Цитохалазин В

ЕКК /2277к/ │ Конконавалин А

Т-лимфоциты /2277к/│ Гидрокортизон (подавляетхе-

Лимфокины сенсибилизированных│ мотаксис;стабилизируетмемб-

лимфоцитов │ рану)

ФГА │ Преднизолон (-"-)

Тафтсин │ Спленэктомия

Опиатные пептиды (хемотак- │ Тиазиды

сические агенты) /7518/ │ Индометацин (аспиринне вли-

Вещество Р │ яет) на образование О425-

Аскорбиновая кислота (вит. С)│ /21Э118-82/

Никотиновая кислота│ аминофиллин

Рифампицин /7506/ │ Pg E1

Ретиноиды (синтетические анало-│ холерный токсин

ги витамина А) │ Антимакрофагальная сыворотка

Секрет слюнных желез пиявок │ Торотраст

/2399к/ │ рентгеновское облучение

Пептиды рога сайгака (сайги) │ коллоидное золото (миокристин)

│ Химически индуцированный

│ канцерогенез

───────────────────────────────┴───────────────────────────────

Клетки могут поглощать значительную часть своей плазматичес-

кой мембраны (до 50% поверхности в час.). /1559к/84/

Самым сильным,специализированным индуктором макрофагальной

активации является гамма-ИФ.Он может индуцироватьэкспрессию

более 100 различных генов в геноме макрофагов. /2461к/95/

ИЛ-4 и ИЛ-13 повышаютэкспрессию макрофагальных маннозных

рецепторов - ММR - маркеров "альтернативной" активации макрофа-

гов). Up-регуляция MMR под влиянием ИЛ-4, ИЛ-13 и PgEможет

быть необходима для вновь рекрутированных моноцитов/макрофагов,

обеспечивающих неспецифический клиренс. /2461к/

Гамма-ИФ и ФНО-альфа,вызывающие"классическую" активацию

макрофагов, снижают количество ММР (down-регуляция) на фоне по-

вышения бактерицидности,цитотоксичностии проявления других

признаков усиленной функциональной активности клеток. Возможно,

ИФ иФНО таким образом переключают активированные макрофаги на

более эффективный фагоцитоз через FcR и СR1 или на внеклеточную

микробицидность, связаннуюс секрецией супероксидных радикалов

в микроокружение. /2461к/95/

┌───────────┐ ТФР-бета,ИЛ-2,

│Т-лимфоциты├── ИФ-гамма,ИЛ-6,───┐

└───────────┘ ГМ-КСФ, │

7ф0-ФНО,7b0-ФНО │

│

┌───────────┐ │

│В-лимфоциты├── - " - /?/ ──────┤

└───────────┘ │

│

┌───────────┐ альфа-ИФ,гамма-ИФ│

│ ЕКК ├── ИЛ-1,ФНО-альфа,──┤

└───────────┘ ГМ-КСФ │

│

┌───────────┐ ТФР-7b0│

│ Моноциты├── ИЛ-1,6,8, ───┤

└───────────┘ Г-КСФ,ГМ-КСФ, │

7ф0-ФНО,7ф0ИФ │

│ ┌──────────┐ ИЛ-1,8,│

Бактерии,грибки,простейшие ──────┼──┤Нейтрофилы├─ФАТ,ФНО-7ф0│

│ └──────────┘ ГМ-КСФ │

┌───────────┐ ТФР-бета, │ ТФР-бета │

│Фибробласты├── ИЛ-6,8,ИФ-бета───┤ │

└───────────┘ Г-КСФ,ГМ-КСФ │ │

│ Другие

┌────────────┐ИЛ-6,ИЛ-8, │ клетки

│Эндот.клетки├─ Г-КСФ,ГМ-КСФ ────┤

└────────────┘ │

│

┌───────────┐ │

│Тромбоциты ├── ИЛ-1,8 ──────────┘

└───────────┘

Схема цитокиновой регуляции антимикробной активности

нейтрофилов. /2343к/94/

_Фенотипы

5- Гамма-ИФ вызывает приобретение макрофагами "воспалительно-

5го" фенотипа.

5- Противоположный воспалительномуфенотип- спониженной

5экспрессией генов провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-альфа,

5МСР-1), пониженной цитотоксичностью, усиленной продукцией ИЛ-6.

5Такой фенотип могутвызвать катехоламины (через альфа- и бе-

5та-адренергические рецепторы),вызывающие повышение уровня

5внутриклеточного цАМФ. /2461к/

5- Под влиянием ИЛ-4, ИЛ-13, Pg E макрофаг приобретает "асим-

5метричный" фенотипсизбирательной активацией "scavenger" ре-

5цепторов типа ММR. /2461к/

5- В затухающем очаге воспаления (в присутствии ИЛ-6) форми-

5руется иной фенотип. /2461к/

Подавление фагоцитозаможет привести к инфекционным заболе-

ваниям, паразитарным инвазиям,злокачественным новообразовани-

ям (тумороцидный эффект макрофагов - ПОЛ), гемобластозам.

Активированные нейтрофилы выделяют ИЛ-1. /2277к/

_2Дефекты фагоцитоза

Снижение фагоцитарной активности может быть обусловлено сле-

дующими дефектами.

1. 1Дефектподвижности0 (хемотаксиса) фагоцитов (синдром "ле-

нивых лейкоцитов") - рецидивирующие или хроническиебак-

териальные инфекции кожи,пазух, легких,среднего уха,

десен. /7514/ Дефект связывания актина. Развивается при

недоедании.Лейкоциты в меньшей степени накапливаются в

кожных окнах. /7685/82/

2. 1Дефект поглощения0 частиц(острыйлейкоз, апластическая

анемия). Дефект фагоцитоза может быть после лечения сте-

роидами. /7685/82/

3. 1Дефект образования гранул и дегрануляции0, причем возможен

дефект образования

- азурофильных гранул (первичный дефицит МПХ /см.ниже/,

миеломоноцитарный лейкоз,миелобластный лейкоз, острый

миелолейкоз),

- специфических гранул (сочетается с нарушениемхемотак-

сиса и противомикробной активности нейтрофилов),

- а также тех и других - 1синдромЧедиака-Хигаши0(неспо-

собность к формированию нормальных фаголизосом; леталь-

ный исход в детском возрасте); /313/

4. 1Дефект внутриклеточного метаболизма0 (облучение, хроничес-

кий гранулематоз,ревматоидный артрит,фиброз легких).

/7476/83/ Фагоциты поглощают микробы,но не убивают их.

/7073/

а) _Хроническая гранулематознаяболезнь.(ХГБ; нарушение

продукцииметаболитов кислорода)-первичное ИД-ое

состояние, возникающее из-за отсутствия или дисфункции

НАДФ-оксидазы в фагоцитах. В итоге не запускается кис-

лородный взрыв,не образуется перекись водорода.Для

больныххарактерен отрицательный NST-тест (с нитроси-

ним тетразолием).

Различают 2варианта семейнойпередачиболезни:

Х-сцепленный (болеют мальчики) и аутосомно-рецессивный

/2225к/95/- отсутствие цитохрома "b" в нейтрофилах.

Приводит к незавершенности фагоцитоза. /7073/

5Идентифицировано несколько мембранных и цитозольных

5компонентов НАДФ-оксидазы (клонированосоответственно

5нескольк ДНК-последовательностей). Мембранные - цитох-

5ром b558 (состоящий из пептидов gp91-фоксир22), в

5цитоплазме - полипептиды р47-фокс и р67-фокс (название

5компонентов "фокс" = phoxот Phagocyteoxydase).В

5процессеактивации клетки оба протеина перемещаются в

5мембрану,где вместе с цитохромом b558 образуют функ-

5циональную оксидазу. /2225к/95/0

4- От 60 до 70%всех случаев болезни - Х-сцепленный

4вариант (кодирующий ген в половой хромосоме),связан-

4ный с дефицитом gp91-фокс;0

4- менее 55% всех случаев - дефект р22-фокс (кодиру-

4ющий ген - в 16 хромосоме и поэтому заболеваниепере-

4дается аутосомно-рецессивным путем). /2225к/95/0

4- Дефекты р47-фокс ответственны за 20%случаев ХГБ

4(кодирующий ген расположен в 7 хромосоме;заболевание

4передается аутосомно-рецессивным путем). /2225к/95/0

4- Дефекты р67 ответственны за 5% ХГБ (белок кодиру-

4ется в 1 хромосоме; передача аутосомно-рецессивным пу-

4тем). /2225к/95/0

Заболевание характеризуется:

-падением продукции перекиси водорода в фагосомах,

- у мальчиков отсутствует НАД- и НАДФ-оксидаза,

- у девочек отсутствует ГПХ (есть часть заболевших

среди девочек); /7685/

Хирургическое лечение+антибиотики позволяют вы-

жить до 20-30 лет. /7685/

При хроническом гранулематозе наиболее частое инфи-

цирование аспергиллами. /7685/82/

Поскольку вфагоцитах микробы защищены от антибио-

тиков, заболевание сопровождается хроническими бакте-

риальными инфекциями (в частности,стафилококковыми),

воспалением различных органов итканей, септическими

осложнениями.Осложнения в виде абсцессов легких, пе-

чени, брюшной полости. (Сепсиса, абсцессов мозга и ме-

нингитапочти небывает-?)./7514,7524/ Одна треть

(1/3) больных погибает до 7 лет.Поэтому заболевание

называется1гранулематозомдетского возраста (синдром

1Джоба)0. /313/

б) 1Недостаточность миелопероксидазы0 (МПХ).Принедоста-

точности МПХ больные восприимчивы

- к кандидам и

- стафилококковойинфекции (лечениеантибиотиками).

/7685/82/

- клебсиеллам

- кишечной палочке,

- серрациям,

- сальмонеллам

- микобактериям,

- аспергиллам

- псевдомонас и др., имеющим каталазу. /2225к/

5. 1Дефект опсонизации0 - низкий уровень комплемента или анти-

тел. Наблюдается при миеломе, агаммаглобулинемии, пораже-

ниях печени.У таких больных отмечаются повторные респи-

раторные инфекции, обусловленные инкапсулированными пнев-

мококками или Haemophilus influenzae. /7514/

6. 1Лейкопения0. Нейтрофилия в крови развивается при первичных

иммунодефицитах,синдроме Костманна, хронической идиопа-

тической нейтропении, синдроме Швахмана, сепсисе, тимоме,

наличии антител к нейтрофилам,нарушении функции Т-суп-

рессоров, гемодиализе. /7476/

7. Нарушения в функции или количестве лейкоцитов,вызванные

лекарствами (1стероидами, антибиотиками0).

_Усиленная фагоцитарная функция.. Игольчатый укол или незначи-

тельная травма без инфицирования могут привести к нагноению или

гнойному артриту.Клиническаякартина утаких больных может

имитировать таковую при подавленной фагоцитарной функции, одна-

ко микробиологические исследования будут отрицательными.

/7514/87/

_1Фагоциты участвуют в развитии воспалительной реакции..

1Нейтрофилы секретируют факторы,индуцирующие апоптоз разных

1клеток-мишеней (_3апоцитоз.1 окружающихклеток). Всвоивакуоли

1нейтрофилы выделяют фактор,индуцирующие апоптоз (ФИА) клеток,

1которые разрушают геном микрообв. Это ферменты с высокой нукле-

1азной активностью (_нуклеазы.). При массивном проникновении в ор-

1ганизм инфекционных агентов нейтрофилы активно поглощают микро-

1бы и,не заботясь об их истинном переваривании,выбрасывают в

1межклеточное пространство значительные количества ФИА. Цель ре-

1акции- произвестив сжатые сроки как можно более выраженное

_1повреждение генетического аппарата микробов.. ФИА губительны для

1всех клеток:они способны осуществить деградацию НК генома лю-

1бых биосистем - эукариотов, прокариотов, вирусов. Нейтрофильные

1ФИАиндуцируют ускорениеапоптозаиусамих нейтрофилов.

1/2226к/97/

1Фагоцитоз и апоцитоз - разные, но фиункционально сопряженные

1процессы. Нейтрофилыспомощью ФИА инициируют воспалительную

1реакцию.Процесс воспаления - это реакцияорганизма наФИА.

1/2226к/97/

1Нейтрофилы - это клетки,у которых включена генетически за-

1данная программаклеточной гибели.На поверхности нейтрофилов

1по прошествии некоторого времени появляются стркутуры,которые

1обусловлены апоптозомикоторые узнаютсямакрофагами (САН -

1структуры апоптоза нейтрофилов). Фагоцитоз "старых" нейтрофилов

1осуществляется макрофагами. /2226к/97/0 - ПОВТОР

3Физиологический аспект

Этапы фагоцитоза: 1. Хемотаксис,

2. Узнавание (адгезия - прилипаниечастиц

к поверхности фагоцита),

3. Поглощение,

3а.Слияние фагосомы с лизосомами,

4. Переваривание.

5. Удаление "отходов". /307/

Первым необходимым условием для осуществления фагоцитоза яв-

ляется накоплениемакрофагов в местах присутствия антигена или

продуктов тканевого распада.

2Хемотаксис 0(приближение или аттракция; для подвижных фагоци-

тов)- направленное движение клетки по или против химического

градиента. [Ориентациянаопределенные сигналы - хемотаксис;

миграция - хемокинез.] Хемотаксис может быть положительным(к

хемоаттрактанту) и отрицательным ("от себя"). /307/

_Хемотаксические факторы. /7519/

- С5а, С5а-deargфрагментыкомплемента (для нейтрофилов);

При дефиците С5а ингибируется инфильтрациянейтрофилов в

очаг воспаления.Вирулентные стрептококки группы А синте-

зируют ингибитор С5а./7508/ Пептидные ингибиторы С5а ис-

пользуются для подавления воспалительного ответа. /7511/

5- калликреин (переводящий С5 в С5а) /7330/87/

5- С3а /2291к/

- ЛТ В4;

- формил-метионил-лейцил-фенилалан,

- ФАТ /2291к,2369к/

- ИЛ-8

- ФНО-альфа

- фактор переноса (лимфокин);

- продукты распада

-- соединительнойткани (пептиды коллагена);

-- иммуноглобулинов (тафтсин -тетрапептид;воздействие

трипсина);

-- фибриногена (фибринопептид В) и другие продукты ССК;

5- факторы хемостаксиса (нейтрофильные,фибробластов, макро-

5фагов - ИЛ-1,лимфоцитов; тучных клеток для эозинофилов);

- опиатные пептиды.

- формилпептидыSt.aureus, E.coli(усиливают экспрессию

CD11b/CD18 наповерхностинейтрофилов) ──760 адгезия к ЭК

──760 проникновение в интерстиций. /2291к/

[0-токсин Cl.perfringensподавляет хемотаксис нейтрофилов,

но не макрофагов.]

Хемоаттрактанты различногопроисхождения

- усиливают движение,

- в 10-20 раз повышают экспрессию рецепторов (нейтрофилов)

/2369к/

-- стимулируют экспрессию молекул адгезии /2291к/

-- увеличивают экспрессию рецептора для С3в (СR1).

Скорость движения макрофагов - 20 мк в минуту.

2Узнавание (адгезия)0:

1. 1Непосредственная адгезия0 (неопсонизирующее распознавание)

проходит по следующим механизмам:

а) Взаимодействие по электростатическому _заряду. (поглоще-

ние полианионов).Показано, что перитонеальные макро-

фаги и купферовские клетки имеют поверхностныерецеп-

торы к анионным частицам. /7522/

б) Поглощение _гидрофобных частиц. (если объект болеегид-

рофобен,чем макрофаги).Большинство бактерий имеют

гидрофобную природу и легко захватуваютсяфагоцитами.

/307/ Комплемент повышает гидрофобность фагоцитируемых

частиц и т.о. усиливает фагоцитоз. Фагоциты имеют мно-

жество участков связывания липида А (ЛПС Г- микробов).

(11.53.304-91)

в) _Интегрины и селектины. (поверхностные рецепторы). С по-

мощью селектиновосуществляется"качание"(rolling)

фагоцитовна поверхности ЭК перед их твердым приклеп-

лением спомощью интегринов к этой поверхности. /2291к/

Интегрины:три гетеродимера,состоящие из общей бе-

та-цепи(CD18) итрехальфа-цепей (CD11a,CD11в,

CD11с). /2291к/

5Интегрин В435 играет главную роль в узнавании апоптоти-

5ческих нейтрофилов. /7964/90/0

На фагоцитах 2 вида селектинов: L (CD62L) и E (CD62E).

/2291к/

г) Синтез _N-ацетилглюкозаминидазы. и тромбоксантина В420 (ТХ

В420) дляфагоцитоза эритроцитови зимозана (грибов).

/7964/

Без опсонинов поглощаются стрептококки,некоторые кишеч-

ные палочки, микобактерии.

2. 1Опсонин-опосредованный фагоцитоз0 проходит через рецепторы

к опсонинам (комплемент-зависимая и др.; антителоза-

висимая, т.е.неспецифическая и специфическая) - вещест-

вам, взаимодействие которых со своими рецепторами приво-

дит к фагоцитозу.

_Опсонины. /7523/

1. Ig G1, Ig G3 - взаимодействие через Fc-рецепторы (ан-

тителозависимый или специфическийфагоцитоз);Ig

А,М,Е,D практически лишены опсонизирующей активности.

2. Фрагментыкомплемента

СR1 - рецептор для С3b, C4b, C5b, С5b67 /?/

CR2 - рецептор для С3d

CR3 - рецептор для С3bi

C1qR -рецептор для субкомпонента С1q (не встречающего-

ся в свободном виде).Активация СR1 приводитк

стимуляции фагоцитарной активности,окислитель-

ного метаболизма ивысвобождению лизосомальных

ферментов. /3032/

Например, через антитела или фрагменты комплемента погло-

щаются микробы (бактерии семейства кишечных,микоплазмы,

стафилококки и др.).

3. С-РБ /7521/,4- рецептор-?

4. Фибронектины (рецептор для фибронектина)

5. Фибриноген, фибрин /?/

6. Рецепторы лектино-подобной природы - С1q и др. (манно-

зо-, галактозо-связывающие и др.) - поглощают объекты,

включающие в свойсостав соответствующиеуглеводные

остатки. = _Лектин-зависимый фагоцитоз. /7520/

4С1q (мембранный С1q). Рецепторную функцию для Fc-фраг-

4ментов иммунных комплексов на макрофагах может вы-

4полнять субкомпонент С1q, который перед выделением

4из клетки включается в мембрану. /3014,3017-255/

На макрофагах обнаружены лектины со специфичностью

к галактозе и к N-ацетилгалактозамину; на альвеолярных

макрофагах и клетках Купфера - лектины маннозноготи-

па. Данный лектин связывается помимо маннозы с N-аце-

тилглюкозамином,глюкозой и фукозой (Г- бактерий, ми-

кобактерий, дрожжей). /7322/88,7513/ Такое взаимодейс-

твие обеспечивает сборку на белке комплексов С1r420-C1s42

и активацию КПК, т.е. С3в-опсонизацию. Белок, связыва-

ющий маннозу,подобен С1q-субкомпонентукомплемента:

М. 700кД,состоит из повторяющихся единиц (32кД).

Низкий уровеньбелка,связывающего маннозу, (<30

мкг/л) связан с повторными инфекциями в возрасте от 6

месяцев до 1,5 лет. /7513/

5Имеется маннансвязывающая протеаза,способствующая

5самоактивации С1r и С1s и такимобразомопределяющая

5лектиновый путь активации комплемента./7234/94/ Ман-

5нозо-связывающая сериновая протеаза проявляетС1s-по-

5добнуюактивность и таким образом активирует компле-

5ментарный каскад. /1995г./

7. Рецепторы углеводной природы, взаимодействующие с лек-

тинами чужеродных объектов (микробов и пр.).

На поверхности фагоцитов имеются интегральныелектиныи

структурныекарбогидраты (мишень для лектинов бактерий),

поэтому связывание происходит двумя путями (Рис. ) Карбо-

гидраты микроорганизмовсвязываются с лектинами фагоци-

тов.

5(При экспериментальномзаражении животных двумя штам-

5мами бактерий - несущих и не имеющих поверхностных лекти-

5нов, поглощались лишь бактерии, несущие лектин; бактерии,

5не имеющие лектина, избегали фагоцитоза и пролиферировали

5в организме хозяина. /7517/)

Третья стадия фагоцитоза - 2поглощение0 проходит за счет сок-

ращения актомиозиновых нитей;мембрана закрывается как застеж-

ка-молния.

Мелкие частицы захватываются при волнобразных перемещениях

складок клеточной мембраны. Для поглощения более крупных частиц

и клеток (эритроцитов,бактерий) типично обтекающее движение -

образование псевдоподий. Фиксированные макрофаги для фагоцитоза

бактерий из кровеносного русла могут "выдвигать" длинные цитоп-

лазматические отросткимеждуэндотелиальнымиклетками. Если

объект диаметромболее 10 мкм,его могут поглощать сразу нес-

колько макрофагов:объект частично дезинтегрируется, фагоцити-

руется и переваривается по фрагментам. /307/

После 50%-ой утилизациимембраныпри фагоцитозе с утратой

большинства поверхностных маркеров восстановление ее происходит

после лаг-фазы продолжительностью 4-8 часов и требует интенсив-

ного синтеза РНК и белка (фосфолипидов,холестерина)./350/

Образование фаголизосом (слияние с азурофильными гранулами и

лизосомами). В аутофагосомах содержатся компоненты самих клеток

хозяина (осколки мембран, митохондрии и др.).

Четвертая стадия - 2переваривание0.

Слияние слизосомами._Лизосомы.- гранулы с диаметром

0,25-0,5 мкм,содержащие большой набор ферментов(кислая фос-

фатаза, бета-глюкуронидаза,МПХ, коллагеназа, фагоцитин, лизо-

цим, катионные белки /лактоферрин, дефензины и пр./). /307/

5В настоящее время особо важное значение придается дефензинам

5- богатым аргининомбелкам, которыеобладаютспособностью

5встраиваться в липидный слой клетки,нарушать ее проницаемость

5и убиватьширокийспектр бактерий,грибовидаже вирусов.

5/2291к/

Первыми вливают своесодержимое вфагосому_специфические

(или вторичные) _гранулы.,содержащие лизоцим,лактоферрин, бе-

лок,связывающих витамин В4120 и пр. Вторыми - _азурофильные. (или

первичные) гранулы, содержащие набор гидролаз, МПХ. /2291к/

Наступает _дыхательный и метаболический взрыв.(вчастности,

поддействием ЛПС Г- микробов).Наблюдается повышенный оборот

фосфолипидов ихолестерина,3-кратное увеличениепоглощения

кислорода и глюкозы, активности НАДФ-оксидазы, усиливается гли-

колиз,повышается продукцияперекиси водорода,активируется

гексозомонофосфатный шунт.

4В результатедыхательного взрыва происходит окисление суль-

4фгидрильных групп мембранных белков до дисульфидов. Процесс ло-

4кальной полимеризации продолжается до тех пор, пока поглощаемая

4частица не будет полностью окружена мембраной. /7527/

Для осуществления движения гранулоциты человека нуждаютсяв

присутствии экзогенной глюкозы, тогда как их фагоцитирующая ак-

тивность зависит от способности сохранять гликоген. /7532,1831,

1601/ Основным источником АТФ фагоцитов является гликолиз, для

альвеолярныхмакрофагов - окислительное _фосфорилирование..

/1770/4Как ивскелетной мышце,вмакрофагах содержится

43-4-кратный молярный избыток креатинфосфата над АТФ. При фаго-

4цитозеснижается содержание креатинфосфата (уровень АТФ не ме-

4няется).0

Биохимические изменения вметаболизме моноцитоввовремя

поглощения:

- Увеличение аэробного и анаэробного гликолиза, гликогенолиза,

- Повышение потребления кислорода,

- Увеличение утилизации глюкозы по гексозо-монофосфатному шун-

ту

- Повышенный оборот фосфолипидов и холестерина

- Временное увеличение концентрации лизосомальных ферментов

- Накопление перекиси водорода

- Секреция пирогенов

а_) Ферментативная деструкция (кислород-независимый процесс)..

Ведущим механизмомдеструкции является синтез активных форм

кислорода (супероксиданиона, синглетный килород, перекись водо-

рода, 5.0ОСl,5.0ОBr, 5.0OJ (галогенизированные формы образуются при

участии миелопероксидазы - МПХ). /2689к/

Кислороднезависимые механизмы проходят преимущественнов

гнойном очаге.

При снижении в лизосомах рН (<7), т.е. через 7-8 минут после

поглощения начинают работать бета-галактозидаза, бета-глюкуро-

нидаза, коллагеназа, липаза, эстеразы, лизоцим, кислая щелочная

фосфатаза, лактоферрин.

В результате все большего присоединения азурофильныхгранул

рН снижается до 4,5 (средняя рН лизосом - 4,7 - 4,8). Расщепле-

ниемубитых микробов начинают заниматься 2кислые протеазы0 - ка-

тепсины и др.(Насчитывают более 80 кислых гидролаз.) Концент-

рация ферментов постепенно увеличивается.

Оптимум рН для катепсина А - 5,0,

катепсина В - 4,8,

катепсина С - 6,0,

катепсина Д - 3,2 и 4,5,

катепсина Е - 2,5. /7475/83/

б_) Деструкция радикалами (кислород-зависимый процесс); 2ПОЛ0.

Поглощение микробафагоцитом сопровождаетсяокислительным

взрывом, в процессе которого _НАДФ-оксидаза. катализирует образо-

вание мощных антимикробных агентов путем превращения молекуляр-

ного кислорода в О425-0.Образование других высокоактивных кисло-

родных метаболитов - перекиси водорода и гидроксильного радика-

ла (ОН5-0) - происходит без участия ферментов,а образование ги-

похлоридного аниона(ОСl5-0)- приучастии _миелопероксидазы

(МПХ). /2225к/95/

[Происходит резкая активация гексозомонофосфатного шунта ──76

образованиеНАДФН ───760 восстановление молекул кислорода на ци-

тохроме b245.Происходит бурное потребление кислорода.Вре-

зультате образуется перекись водорода,различные радикалы кис-

лорода,МПХ запускается мощнаясистема галогенирования,что

сопровождается гибелью микроорганизмов.

Глюкоза + НАДФ ───760 шунт ────760 пентофосфат + НАДФН

НАДФН + 0420 ──760 цит.в245 ──760 НАДФ5+0 + 0425-0(надпероксидный анион)

Фермент, обеспечивающий образование ключевого окислительного

элемента - 0425-0, представляет собой,по-видимому, мембраносвязан-

ный флавопротеид,использующийв качестве физиологического

агента НАДФ. В основе продукции супероксида лежит использование

активной формы железа и некоторых других соединений несамого

нейтрофила, а клетки-мишени. /7516/

20425-0 + 2Н5+0───760 спонтанная дисмутация──760 Н4200420 + 5100420 (синглетный

кислород)

Н4200425 0+ 0425-0 ──760 5100420 + ОН5-0 + ОН5.0 (свободный гидроксил)

Н4200420+ Сl5-0 ────760 МПХ ────760 ОСl5-0 + Н4200 ───760О420 + Сl5-0 + Н4200

20425-0 + 2Н5+0───7600420 + Н4200420 (фермент - надпероксиддисмутаза)

Н4200420 ─────760 каталаза ─────7602Н4200 + 0420 ]

Сами фагоцитызащищаются отрадикальных форм ферментами -

антиокислительной системой (СОД,каталазой,наличием глутати-

он-восстановительной системы).Содержаниепероксидазы снижено

при ревматизме,туберкулезе, инфаркте миокарда, опухолевых за-

болеваниях. /7515/

Ацетилсалициловая кислота (60 мкг/мл) не влияет на потребле-

ние кислорода и образование супероксида; индометацин ингибирует

потребление кислорода и образование супероксида. /21Э118-82/

Окислительные и другие метаболиты фагоцита посистемемик-

ротрубочек поступаютвнутрь фаголизосомы и обеспечивают бакте-

рицидный и тумороцидный эффект макрофагов.

В результате потребления ионов водорода (особенно в условиях

гнойного очага воспаления, не снабжающегося кислородом) повыша-

етсярН исоздаются оптимальные условия для работы 2катионных

2белков0 (катепсина G) и лизоцима.Катионные белки усиливают ге-

нерацию супероксида. /7477/88/

Деструктированные объекты окончательно перевариваются глико-

литическими, протеолитическими,липолитическими и прочими фер-

ментами фагоцитов.Мономерные субъединицы (аминокислоты, моно-

сахара, глицерин,жирные кислоты, нуклеотиды) включаются в об-

щий метаболическийпроцесс организма,чужеродные углеводные и

др. субстанции выбрасываются в кровоток и выделяются с мочой, а

непереваренные антигенныедетерминанты встраиваются в процессе

экзоцитоза в наружную мембрану,образуют комплекс с антигенами

HLA II класса и запускают иммунный ответ. Некоторые авторы счи-

тают, чтофагоцитоз ифункциюантигенпредставляющихклеток

(АПК) осуществляют разные субпопуляции клеток.

Образуется оксидазота (NO)./2319к/97/Активизированные

нейтрофилы (супернатант) обладают цитотоксическими свойствами в

отношении опухолевых и ВПК. Эффект не связан с активными форма-

ми кислорода, дегрануляцией, метаболитами АК. /2319к/97/

3 2исхода фагоцитоза0: гибель микроба, гибель фагоцита, симби-

оз. Различают завершенный и незавершенный фагоцитоз. При неза-

вершенном фагоцитозе микробы поглощаются,но не погибают ине

преревариваются, аиногда размножаются(покидаютфагосому и

циркулируют в цитоплазме).В случае завершенного фагоцитозав

дальнейшемпроисходит экзоцитоз (выброс продуктов деградации)

или регургитация (выброс неполностью закрытой фагосомы- ?).

4Механизмом экзоцитоза выбрасываютс из клетки белки, синтези-

4рующиеся на рибосомах ЭПС.Они переходят в цистерны эпс, затем

4аппарат Гольджи, направляются к поверхности клетки, сливаются с

4мембраной клетки и содержимое выходит из клетки.

5Микробы, которые поглощаются /350/84/

5───────────────────────────────────────────────────────────────

5без опсонизации │через комплементарные │через комплементарные

5│или Fc-рецепторы │и Fc-рецепторы

5───────────────────────────────────────────────────────────────

5шероховатые формы микоплазмы Е.с. капсулированная

5пневмококков стафилококки с (с капсульным АГ)

5стрептококки белком А сальмонеллы с Vi-АГ

5(без гиалурон.к-ты

5и М-белка)

5нек.штаммы Е.с.,

5стафилококков,

5микобактерий,

5гонококки

5───────────────────────────────────────────────────────────────

Эволюционно сформированные 2механизмы защиты микробов отфа-

2гоцитоза0:

1) Капсулы пневмококков,сибиреязвенных бацилл,клебсиелл,

СГ идр. микробов.К-антигены кишечной палочки,сальмонелл

(капсульные АГ). Полисахариды менингококков, возбудителей чумы,

микоплазм. Если микробы декапсулировать, то они фагоцитируются.

2) Белок А стафилококка, белок М стрептококков, представляю-

щиефункционально белки,подобные Fc-рецепторам (сцепление с

антителами происходит не антиген-связывающей областью

/Fab-фрагментом/, а эффекторным звеном /Fc-фрагментом/, поэтому

антитела неспецифическипоглощаются,но немогутвыполнить

Fc-зависимыхфункций - проактивировать фагоцитоз или систему

комплемента).

3) ЛПС энтеробактерий, воскоподобный слой микобактерий, гиа-

луроновая кислота стрептококков, бледной трепонемы.

4) Изменение метаболизма фагоцитов

- Пероксидаза,каталаза многих микробов (антиоксиданты бло-

кируют ПОЛ в фаголизосомах). При ряде ООИ.

- Блокада слияния фагосомы и лизосомами (у ряда микробов).

- Индукция тормозных медиаторов - ТФР-бета, ИЛ-10 макрофага-

ми (Lrishmania spp.,Trypanosoma cruzi,Mycobacterium avium)

/2461к/95/──760подавление окислительного и пр.метаболизма,

внутриклеточная персистенция.

- Дифтерийныйтоксин ипр.(холерный токсин активирует =

адъювант) ──760 изменение метаболизма фагоцитов.

- Изменение процессов фосфорилирования клеточных белков, ак-

тивности протеинкиназы С, Са52+0-зависимого пути передачи сигна-

лов.

5) Пили гонококков препятствуют поглощению микроба.

Зачастую фагоцитозопсонизированных антителами микробов за-

вершенный, неопсонизированных - незавершенный.

см. материал по практическим занятиям

2Практические занятия

- Определение абсолютного и относительного числа нейтрофилов

и моноцитов

- Определение фагоцитарной активности нейтрофилов.

ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ

Фагоцитозом называется поглощение клетками микробов иличу-

жеродных частиц.Снижение числа нейтрофилов ниже 25%от нормы

опасно для жизни. /2269к/

┌─после комплементарного лизиса ─── АПК, КПК ── АТ

Фагоцитоз ┼─после "работы" антител (ИК) ─── уровень АТ

└─комплексов с фибронектином,альфа-2-макроглобу-

лином, С-РБ, лектинами и пр.

Для изучения поглощенияиспользуютбактериальные клетки

(St.aureus или E.coli), дрожжи, латексные частицы. Более интен-

сивно фагоциты поглощают чистицы,обработанные сывороткой, со-

держащей опсонины (Ig G,комплемента, фибронектин, СРБ и др.).

/2291к/

При определении фагоцитарной активности определяют следующие

2показатели:

- фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих нейтрофи-

лов к общему количеству нейтрофилов;

- фагоцитарный индекс - среднее число микробных тел,захва-

ченных каждой клеткой;

- опсонический индекс

- переваривающаяспособность -постепенное уменьшение ( в

течение 50-60 минут) интенсивности окрашивания фагоцитированных

микробов вплоть до их полного обесцвечивания;

- завершенностьфагоцитоза - отношение лейкоцитов с завер-

шенным фагоцитозом к общему числу лейкоцитов с фагоцитированны-

ми микробами, выраженное в процентах. /272-53/

_2Методики.1:

Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro

и в условиях in vivo.

I. In vitro.

- Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК;

- Радиометрические методы изучения стадии захвата.

- Тест восстановлениянитросинеготетразолия. По реакции

восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции гек-

созомонофосфатного шунта. /1583-4/

II. In vivo.

Белым мышам вводят в/бр.2мл стерильного МПБ, чем вызывают-

локальный лейкоцитоз.Через 4 часа в/бр.вводят 1мл 2млрд-ой

культуры Staphylococcusalbus.Через 10-15 минут из перитоне-

альной жидкости готовят мазки (можно из осадка после центрифу-

гирования), окрашивают метиленовым синим.

2Незавершенный фагоцитоз0 (наблюдается при поглощении туберку-

лезных палочек,возбудителей лепры,лейшманиоза, гонореи, ме-

нингококков, вирусов, риккетсий) :

Рис. "Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)"

Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отно-

шение умерщвленныхи всех поглощенных микробов (примерно равно

0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ):

- высокая ЗФ (1,0-0,82);

- средняя (0,81-0,45);

- слабая (0,44-0,32);

- очень слабая (0,31-0,29)

- ЗФ отсутствует (0,28-0,25)

2Фагоцитарная активность

(фагоцитоз стафилококка)

Реакцию осуществлялипо методуН.В.Васильева и соавт.

(1972).Для постановки реакции в лунки иммунологического план-

шета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл

цельной крови,взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х

10590 микробных тел/мл суточной агаровой культуры Staphylococcus

aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. В опытные

лунки вводили по 10 мкл расстворовизучаемыхполипептидов, в

контрольные - 10 мкл фосфатного буфера.Лейкоцитарно-микробную

взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С втече-

ние 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкуба-

ции взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 ми-

нут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной

иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах. Поглотительную спо-

собность фагоцитов оценивали по следующим показателям:

1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших кле-

ток из числа сосчитанных нейтрофилов;

2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощен-

ных одним активным нейтрофилом.

Для оценки переваривающейфункции нейтрофилов определяли

показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле:

общее количество переваренных микробов

ПЗФ = ────────────────────────────────────── х 100 %.

общее количество поглощенных микробов

Чувствительным методомоценки функциональной активности фа-

гоцитов являетсяметодопределения хемилюминесценциикрови.

/7062/

- Приготовитькровяно-микробнуювзвесь (0,05мл 2%цитрата

натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микро-

кокков);

- для определения опсонического индекса в опытную пробудо-

полнительно добавляетяантисывороткак микробам или сыворотка

больного для определения функциональной активностиантителк

микробам;

- выдержать в термостате 30 мин. при 37500С.

- приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси;

- высушить мазок,окрасить по методу Филлипсон:краситель

Романовского развести этиловым спиртом 1:3.На высушенный пре-

парат наносят5 капель красителя и выдерживают 5 минут (однов-

ременная фиксация и окраска).Не сливая краску,добавляют во-

допроводную воду, 5 капель на 5 минут. Промывают водой, высуши-

вают, микроскопируют с иммерсией.

- В мазке определяют

а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейко-

цитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают

100 гранулоцитов и,например, если 35 из них водержат

микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%.

б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганиз-

мов, поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное

количество микроорганизмов, например, 567 во всех фаго-

цитирующих гранулоцитах /80/ и делят начисло фагоци-

тов. Частноеотделения (567:80=7) отражает сруднюю

поглотительную способность одного фагоцита.

в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ).Для этого

либо рассчитывают частное от деления ФЧ(фагоцитарного

числа) больногона ФЧздорового донора (при этом ОФИ

должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпири-

ческим методом,с помощью которого анализируют состоя-

ние 25 нейтрофилов по следующей схеме:

──────────────────────────────────────────────────────────────

Количество микро-│Оценка фагоцитоза│Количество нейт- │ ОФИ

бов, фагоцитиро- │ │рофилов с данной │

ванный одним │ │степенью фагоци- │

гранулоцитом │ │тарной активности│

──────────────────────────────────────────────────────────────

0 0 2 0х2=0

от 1 до 20 + (один) 5 1х5=5

от 20 до 40 ++ (два) 10 2х10=20

от 40 и более +++ (три) 8 3х8+24

Итого:ОФИ=49

Максимальное значение ОФИ - 75,т.е. во всех 25 нейтрофилах

фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ ра-

вен 10.

ОФИ от 10 до 24 - слабо положительный (+);

от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++);

от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++).

Полученые результаты внести в протокол.

Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%.

Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?.

Фагоцитарное число после обработки микробов антителами(им-

мунной сывороткой) или комплементом -

Опсонический индекс - больше 1.

Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие

антител идет плохо,при наличии антител в сыворотке или плазме

фагоцитоз ускоряется,при добавлении комплемента или активации

комплемента вкрови исследуемогофагоцитоз резко ускоряется,

т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

2Оценка степени перекисного и радикального окисления

2по НСТ-тесту0 (NBT-тест)

1Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Тест бессубстратноговосстановлениянитросинего тетразолия

основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с обра-

зованием высокореактогенныхсвободных радикалов.НСТ является

индикатором респираторного взрыва.Сущность метода заключается

в образованиинерастворимыхокрашенных зеренформазанапри

восстановлении НСТ супероксидным радикалом.

Метод высокоинформативен

- для оценки функциональной активности фагоцитов,

- прогнозирования тяжести заоблевания,

- контроля заэффективностьюантибактериальноголечения,

- дифференциальной диагностики вирусных и бактериальныхза-

болеваний и пр. /2291к/

- Получены доказательства высокого уровнякорреляциимежду

образованием активных форм кислорода и киллингом.

Метод Н.Е.Виксмана,А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы

веществв количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического

планшета,в контрольные лунки - 20 мкл среды 199.В каждую из

лунок вносили по 20 мкл цельной крови,взятой из пальца здоро-

вых людей пипеткой,предварительно промытой раствором гепарина

250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетра-

золия (Reanal,Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферномрастворе,

рН 7,2.Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали

при температуре 375о0С в течение 30 минут,встряхиваяпланшеты

каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, гото-

вили мазки и высушивали на воздухе.Готовые мазкификсировали

метанолом10 минут,высушивали и докрашивали 0,5%раствором

сафранина.

В качестве активаторов фагоцитов рекомендуется использовать

опсонизированный зимозан или акктиватор протеинкиназы С - фор-

болмиристат ацетат. /2291к/

Об интенсивности радикалообразования судят по количеству ди-

формазана, которыйоткладывается в виде грубодисперсных темно-

синих гранул внутри или на поверхности активированного нейтро-

фила./7062/

При микроскопии в каждом мазке подсчитывали 100нейтрофи-

лов, среди которых определяли процент клеток, содержащих отло-

жения диформазановых гранул (НСТ-позитивные нейтрофилы).Далее

расчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН) по формуле:

А х 0+Б х 1+ В х 2+Г х 3

ИАН = ─────────────────────────────────── ,

100

где: А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложе-

ний;

Б - количество клеток, в которых площадь отложений диформа-

зана не превышает 1/3 площади ядра;

В - количество клеток, в которых названные отложения зани-

мают от 1/3 до всей величины ядра;

Г - количество клеток с диформазановыми отложениями по пло-

щади превосходит площадь ядра.

НСТ-тест можетбыть сделанбездополнительной стимуляции

(спонтанный НСТ-тест) или после стимуляции нейтрофилов in vitro

(индуцированный НСТ-тест). /7062/

При патологии чаще ПОЛ растет.Поэтому если лечение выбрано

правильно, то процент активированных нейтрофилов быстро падает,

опережая динамику лейкоцитарных сдвигов, СОЭ и др. /7062/

Сниженные показателиНСТ-теста ──760 неблагоприятныйисход

(сепсиса)

Повышенные показатели НСТ-теста ──760 опасность развития гной-

ных осложнений после операции.

Нормальные показатели НСТ-теста ──760 успешная терапия. /1365к/

[Преципитат с НСТ может образовыватьгепарин. /1575к/90/]

На стекла с прилипшими клетками капают 5капель (0,14мл)

1,03% раствора нитросинего тетразолия (17мг на 14 мл).

2Лизосомально-катионный тест (ЛКТ)

Растворами исследуемых полипептидов по 50 мкл заполняли лун-

кииммунологическогопланшета, вкоторыевносили по 20 мкл

цельной крови здоровыхдоноров,взятой соскарифицированной

ранкипальца руки при помощи пипетки,предварительно промытой

раствором гепарина 250 ед/мл.Полученную взвеськлетоккрови

инкубировали 1 час при температуре 37С. После инкубации готови-

ли мазки, сушили на воздухе при комнатной температуре и окраши-

вали по методу В.Е.Пигаревского и соавт. (1981) в 0,1 % забуфе-

ренном спиртовом растворе зеленого прочного с рН 8,2 в течение

20 минут.Дополнительную окраску мазков проводили 0,25% водным

раствором азура А.Окрашенные препараты промывалидистиллиро-

ваннойводой, высушивалина воздухе и микроскопировали с ис-

пользованием масляной иммерсии.

При исследовании просматривали 100 гранулоцитов.Внутрик-

леточное содержаниекатионных белков крови оценивали полуколи-

чественно повеличине среднегоцитохимическогокоэффициента

(СЦК), вычисляемого по формуле:

3а +2б+ 1,5в+1г +0,5д+0а

СЦК = ─────────────────────────────────────────,

100

где: а-е - количество однотипных клеток с определенной степенью

окрашиваемости цитоплазмы зеленым прочным, а цифры

показывают степень выраженности окраски;

0 - отсутствие окраски;

0,5 - наличие в цитоплазме единичных окрашенных гранул;

1 - половина цитоплазмы заполнена светлоокрашенными гра-

нулами;

1,5 - цитоплазма равномерно заполнена гранулами,окрашен-

ными в светло-зеленый цвет;

2 - цитоплазма содержит 1/3 часть своей площади темно-

зеленых гранул;

3 - цитоплазма содержит 2/3 части своей площадитемно-

зеленых гранул.

2Определение хемотаксической активности лейкоцитов

Недостаточный хемотаксиссдерживает мобилизацию фагоцитов,

способствуя опережающему размножению бактерий. Снижение мигра-

ционной активности нейтрофилов в 2 раза сопровождается затяжным

торпидным течением пневмонии более чем у 50% детей. /7062/