Материалы по экологии Биоиндикация на клеточном и субклеточном уровне
Биоиндикация
КЛЕТОЧНЫЙ И СУБКЛЕТОЧНЫЙ УРОВНИ
Биоиндикация на уровне клетки выявляет следующие результаты действия поллютантов:
-нарушение биомембран;
-изменение концентрации и активности макромолекул;
-аккумуляция вредных веществ;
-нарушение физиологических процессов в клетке;
-изменение размеров в клетке.
Лабораторная работа №1 Влияние солей тяжелых металлов на коагуляцию белков растительного и животного происхождения
Цель: определить влияние солей тяжелых металлов на коагуляцию белков различного происхождения.
Ход работы:
Приготовить в пузырьках от пенициллина серию растворов сульфата меди и нитрата свинца из исходного 5 % раствора.
В 8 пробирок пипеткой внести по 1 мл животного белка, а в другие 8 – по 1 мл растительного белка.
В каждую из пробирок внести по 2 капли одного из указанных растворов испытуемой соли. Все пробирки пометить стеклографом. Рассмотреть характер коагуляции белков на темном фоне.
Определить концентрацию раствора соли, при которой происходит коагуляция белка.
Приготовление растворов белков:
У куриного яйца отделить белок в мерный стаканчик, размешать его стеклянной палочкой в дистиллированной воде в соотношении 1:10. Затем профильтровать.
Зерновой вызревший горох перемолоть в муку в кофемолке, развести в соотношении 1:10. Профильтровать.
Лабораторная работа №2 Определение температурного порога коагуляции белков цитоплазмы клеток разных растений
(по Л. И. Вигорову)
Цель: определить температурный порог коагуляции белков цитоплазмы клеток разных растений.
Ход работы:
Взвешивают 3-5г листьев разных древесных растений. Растирают в ступке с 4 мл воды. При смыве ступки добавляют еще 6 мл воды. Отделяют более крупные частицы разрушенной ткани фильтрованием через вату.
Помещают зеленый раствор в пробирку и, медленно нагревая жидкость на водяной бане, отмечают температуру, при которой происходит коагуляция белков, извлеченных из разрушенных клеток. В результате устанавливается ряд устойчивости разных видов древесных растений к высоким температурам.
Лабораторная работа №3 Влияние солей тяжелых металлов на плазмолиз протоплазмы растительной клетки
Цель: определить влияние солей тяжелых металлов на протоплазму растительной клетки.
Ход работы:
Приготовить 5 % (или другой концентрации) растворы сульфата меди или нитрата свинца.
Заменить воду на временном препарате растительной клетки растворами биогенных и небиогенных солей. Замена производится способом 4-5 кратного накапывания раствора соли с одной стороны покровного стекла и отсасыванием кусочком фильтровальной бумаги с другой до полной замены воды раствором соли.
Оставить клетки в растворе солей на 15 минут. Когда плазмолиз будет хорошо заметен, рассмотреть препарат, сделать выводы.
Выявить комплексное действие повышенной температуры и одной из наиболее токсичных солей. Для этого препараты, в которых вода заменена на раствор соли, выдерживают 10 минут на водяной бане при температуре 40 0С. Потом рассматривают в микроскоп и зарисовывают. Сделайте выводы относительно увиденного.
Лабораторная работа №4 Влияние низких температур на коагуляцию белков у растений
Цель: определить влияние низких температур на коагуляцию белков у разных растений.
Ход работы:
1. Взвешивают 23 г молодых листьев древесно-кустарниковых растений. Растирают в ступке с 4 мл воды, добавив 6 мл при смывании, отделяют обрывки тканей центрифугированием и разливают зеленый раствор хлорофиллпротеида в пробирки.
2. Замораживая растворы во всех пробирках в смеси снег-соль, рассматривают их через каждые 5 мин; отмечают разницу в замерзании растворов от разных растений.
Опыт показывает разное время замерзания растворов и разную степень коагуляции белков у различных растений при замораживании.
3. Результаты записать в таблицу
№
п/п
Семейство, вид растения
Температура коагуляции, (єC)
Приготовление охладительной смеси: к 3 частям снега добавляют 1 часть поваренной соли, тщательно перемешивают лопаточкой (температура должна быть -20°С). Изолировать смесь в ведерке плотной бумагой.
Лабораторная работа №5 Выявление аберрации хромосом под действием химических мутагенов
Цель: оценить влияние химических мутагенов на меристемы корней разных растений.
Ход работы:
Замочить семена злаков, огурца, тыквы, свеклы, гороха и др. в воде в течение 11,5 сут. при температуре 25 0С, используя для проращивания чашки Петри. Важно определить время наступления первых митотических делений в клетках для точной постановки опыта влияния химических мутагенов. Например, у подсолнечника первые митозы наблюдали в корешках длиной 68 мм, у гречихи - 5 мм, у конских бобов - 1012 мм, у гороха - 1012 мм, у скерды - 2 мм, у некоторых злаков - 1,52,5 мм, у пшеницы - 10 мм.
Проростки различных семян при вероятном начале митозов подвергнуть действию химических мутагенов (в течение суток). Для этого использовать растворы различной концентрации тяжелых металлов и др.
За 2 часа до фиксации проростков поместить их в холодильник на 1-3 часа. Низкая температура способствует спирализации хромосом. Зафиксировать препараты в фиксаторе Карнуа (6:3:1), уксусном алкоголе (3:1) и др. Зафиксированный материал хранят в холодильнике в фиксаторе или промывают в 70% растворе спирта до окрашивания.
При изготовлении временных давленных препаратов важное значение имеют способы мацерации тканей. Для этого используют 45% уксусную кислоту или 1 н соляную кислоту. Окрашивают препараты ацетокармином, ацеторсеином и др. Для приготовления «давленных» препаратов из апикальной меристемы и их окрашивания корешки поместить на предметное стекло в каплю красителя и подогреть над пламенем спиртовки, доводя до легкого кипения несколько раз, особенно в том случае, если не проведена мацерация в НС1. Корешки злаков труднее окрашиваются и мацерируются, поэтому приходится увеличивать время их окрашивания. Например, корни ячменя, пшеницы, ржи иногда выдерживают в ацетоорсеине от одних до полутора суток при комнатной температуре.
На предметное стекло, где расположен объект, нанести каплю 45%-го раствора уксусной кислоты, отделить конус нарастания, удалить лишние ткани, накрыть покровным стеклом и фильтровальной бумагой и постукивать сверху, например тупой стороной карандаша, чтобы уложить клетки конуса нарастания в виде монослоя.
В каждом препарате анализировать все метафазы, учитывая долю клеток с аберрациями хромосом. Анализ спектра аберраций провести по известной классификации с выделением хроматидных (одиночных) и хромосомных (двойных) фрагментов (рис. 1, 2). В отчете представить рисунки аберраций.
Сделать вывод о влиянии химических мутагенов на цитогенетические характеристики клеток корневой меристемы растений.
Для получения интегральной характеристики цитогенетического состояния живых организмов В.М. Захаровым предложена балльная шкала:
1 балл - условно нормальное состояние, частота аберрантных клеток до 5 %.
2 балла - низкая степень изменений, частота аберрантных клеток в пределах 610 %.
3 балла - средняя степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 1115 %.
4 балла - высокая степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 1620 %.
5 баллов - критическое состояние, частота аберрантных клеток выше 20 %.
7. Рассчитать частоту хромосомных аберраций, учитывая общее число клеток и клетки с хромосомными аберрациями, по формуле: Ч = А 100/В, где А - число клеток с нарушениями, В - общее число просмотренных клеток.
Если в одной клетке обнаружено несколько типов нарушений, число клеток с нарушениями будет меньше общего числа аберраций. Число аберраций на клетку (или 100 клеток) устанавливают, разделив общее число аберраций (С) на число просмотренных клеток (В).
8. Рассчитать спектр аберраций (К) по формуле:
К = Д 100/В, где Д - число аберраций определенного типа; В - число просмотренных клеток.
9. Определить долю аберраций каждого типа от общего числа всех аберраций, разделив число аберраций одного типа (Д) на общее число аберраций (С). Поврежденность клетки (%): общее число аберраций (С)/ число аберрантных клеток (А).
10. Оценить в баллах влияние мутагена на проростки злаков.
Фиксаторы
Фиксация материала, т. е. быстрое умерщвление клеток в специально подобранных растворах ядовитых реактивов, которые называются фиксаторами, прерывает тот или иной процесс в клетке, вызывая необратимые изменения. При этом коллоиды протопласта переходят в нерастворимое состояние.
Известно много фиксаторов, но каждый из них имеет определенное назначение. Важно выбрать такой фиксатор, который, убивая клетку, несильно искажает ее прижизненную структуру и отвечает целям исследования. Обычно фиксатор представляет собой смесь нескольких реактивов, каждый из которых редко используется для фиксации вследствие одностороннего действия. В состав этих смесей могут входить: ледяная уксусная кислота, хромовая кислота, формалин, хлороформ, осмиевая кислота, спирт и др.
Уксусная кислота (СН3СООН) – бесцветная жидкость с резким запахом. Хорошо смешивается с водой, спиртом, эфиром, хлороформом. Кислота хорошо сохраняет форму хромосом, но разрушает митохондрии и комплекс Гольджи. В последние годы ее нередко заменяют при фиксации пропионовой кислотой, которая способствует лучшей фиксации и окрашиванию объектов.
Хромовая кислота проникает в объекты не очень быстро, коагулирует белки, сохраняет детали строения ядра, цитоплазмы, а также митохондрии и комплекс Гольджи. После фиксации хромовой кислотой объект необходимо тщательно промыть водой, иначе образуется осадок, мешающий окрашиванию тканей.
Осмиевая кислота представляет собой раствор сильного окислителя – тетраоксида осмия. Эта кислота медленно проникает в объект и вызывает наименьшие изменения в структуре цитоплазмы и ядра. Позволяет фиксировать митохондрии.
В цитологических и эмбриологических исследованиях широко применяют, особенно для изготовления давленных препаратов, «уксусный алкоголь», или фиксатор Кларка (3:1). Материал выдерживают в фиксаторе 212 ч, а иногда и хранят в нем при 03 °С. Состав уксусного алкоголя: абсолютный этиловый спирт или его 96 %-й раствор – 3 части, ледяная уксусная кислота –1 часть.
Красители
Ацетокармин. Растворить 1 г (лучше 24 г) кармина – красящего вещества, состоящего из кармиловой кислоты, - в 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды. Растворение проводить в колбе с обратным холодильником на водяной бане с подогревом около 3 ч. При отсутствии обратного холодильника в колбу вставить воронку. После остывания темно-красный раствор кармина отфильтровать и поместить в посуду с притертой крышкой. Остатки кармина на фильтре можно использовать повторно.
Ацетоорсеин. Готовят из орсеина – красителя, полученного из лишайника. Растворить 1 г орсеина в 45 мл горячей уксусной кислоты и добавить 55 мл дистиллированной воды. Кипятить на водяной бане 3 ч, остудить и отфильтровать.
Ускоренный метод приготовления давленных препаратов
Дайер предложил фиксировать материал в смеси этилового спирта, уксусной кислоты, хлороформа и формалина (10:2:2:1) в течение 5 минут. Мацерацию проводил в 1 н растворе НCL при 60 °С в течение нескольких минут в зависимости от объекта. Окрашивают объект в течение 23 минут в смеси орсеина, молочной и пропионовой кислот.
Рисунок 1- кариотипы: А- ячменя,
Б- ржи, В- гороха, Г- лука Рисунок 2- Классификация аберраций
Лабораторная №6 Использование традесканции для оценки мутагенного и токсического действия факторов окружающей среды
Цель: оценить влияние мутагенного и токсического действия факторов окружающей среды на традесканции.
Ход работы:
Традесканция (семейства Коммелиновые) имеет дикий тип окраски цветков и клеток волосков тычинок - голубой (доминантный), розовый (рецессивный). Окраска тычиночных волосков завершается за 3 дня до начала цветения, поэтому бутоны традесканции, прошедшие эту стадию к моменту начала индуцированного воздействия не должны учитываться в эксперименте. На каждой тычинке формируется в среднем 45 волосков. Волосок - это меристематические, последовательно расположенные клетки. Тычинки последних цветков в старых соцветиях имеют 3032 волоска. Физические и химические факторы кроме мутагенного оказывают и токсическое воздействие, которое оценивают по потере репродуктивной способности клеток. Для определения волосков, остановившихся в росте, необходимо установить число клеток в волоске. Остановка деления клеток может происходить в любом волоске по всей длине тычинки. У её основания волоски состоят из 2325, в средней части - 2223, около верхушки – 1216 клеток, причем 95% волосков в верхней части тычинки сформировано 12 клетками (рис. 3). Такие волоски считают нормально развивающимися, с меньшим числом - низкорослыми, учитывают как потерявшие репродуктивную способность.
Рисунок 3- Остановившиеся в росте волоски тычинки традесканции
2. Подготовка проб и растений к эксперименту. Отфильтрованную через фильтровальную бумагу пробу воды разлить в 3 установленные в штативе пробирки. Объем воды во всех пробирках должен быть одинаковым (желательно не менее 25 мл). Пробы воды можно отобрать вблизи дорог или промышленных предприятий из поверхностных водоемов – ручьев, рек и т. п. При возможности лучше протестировать пробы не менее чем в трех повторностях.
3. В следующие три пробирки разлить дистиллированную воду (контроль) в том же объеме (по 25 мл на пробирку).
4. Еще 3 пробирки заполнить раствором стандартного мутагена (положительный контроль), например 1 н раствором малеинового гидразида (или других мутагенов).
5. Срезать девять черенков традесканции с соцветиями, в которых распустился первый цветок. Длина черенка - 20 см от соцветия. Распределить по одному черенку на каждую пробирку. Зафиксировать время начала эксперимента. Через 24 ч (время воздействия регулируется в зависимости от степени токсичности образца и целей эксперимента) все растения перенести в чистые пробирки со свежей дистиллированной водой.
6. На четвертый день от начала эксперимента начать анализ соматических мутаций и потери репродуктивной способности клеток волосков тычинок,
Подготовка препаратов для микроскопических исследований
Распустившийся цветок, время жизни которого ограничено несколькими часами, срезают утром. Аккуратно отворачивают лепестки и, зажав их указательным и большим пальцами левой руки, срезают тычинки, держа лезвие в правой руке. Тычинки необходимо срезать по одной у самого основания, не повреждая клетки волосков. Затем тычинки кладут на заранее приготовленное предметное стекло в вазелиновое масло (рис. 4). Следует использовать небольшое количество вазелинового масла, чтобы препарат не «плавал» в нем, иначе волоски сложно равномерно распределить по обеим сторонам тычинки.
Настроить бинокулярную лупу обычным способом. Используя увеличение не более 10 х 4 и матовый фильтр, начать анализ препаратов. Левая рука при этом находится на винте настройки из ображения, а в правой экспериментатор держит препаровальную иглу и с ее помощью при необходимости поправляет волоски тычинок.
Рисунок 4- Тычинки, помещенные в вазелиновое масло на предметное стекло
Клетки волосков имеют голубую окраску, поэтому трудностей с распознаванием розовых мутантных клеток (секторов) не воз никает. Одна розовая клетка или сектор (несколько идущих подряд розовых клеток, не разделенных голубыми) регистрируются как одно мутантное событие.
В каждой тычинке внимательно просматривают волоски и те из них, которые образованы менее чем 12 клетками, учитывают как укороченные (stunted). После учета нарушений, подсчитывают количество волосков в одной из тычинок. Результаты заносят в таблицу. Затем анализируют следующий цветок.
Частота соматических мутаций и потеря репродуктивных способностей клеток могут быть рассчитаны либо по дням для каждого варианта опыта, или для каждого растения за весь период наблюдения. При этом используют формулу: А = 100 В / С (%), где А – частота соматических мутаций, В – Число всех зарегистрированных для данного опыта розовых мутантных секретов, С – сумма проанализированных волосков тычинок.
D = 100 Е / С (%), где D - потеря репродуктивной способности клеток; Е – число всех зарегистрированных укороченных волосков для данного опыта; С - сумма проанализированных волосков тычинок.
По общепринятой методике Г. Крамера проводят расчет средних значений и стандартных отклонений частот нарушений в волосках тычинок. Статистическая обработка данных может включать анализ распределений и проверку выборок на наличие выбросов. Оценивают достоверность отличия частот повреждений, регистрируемых в опытных образцах и контроле. Полученные результаты представить в виде таблиц и диаграмм.